H9N2亚型禽流感非结构蛋白NS1A基因的克隆、表达及其诱导Hela细胞凋亡的研究

论文题目: H9N2亚型禽流感非结构蛋白NS1A基因的克隆、表达及其诱导Hela细胞凋亡的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 孙博兴

导师: 张玉静

关键词: 禽流感病毒,蛋白,细胞,原核表达,真核表达,细胞凋亡

文献来源: 吉林大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本研究应用现代分子生物学的研究手段和方法研究了H9N2 亚型禽流感病毒非结构蛋白NS1A 在体外培养的Hela 细胞中的表达及其对Hela 细胞的生长抑制和诱导凋亡的作用。首先用病毒总RNA 做模板通过RT-PCR 扩增了NS1A基因,将其克隆入pMD18-T 载体,再亚克隆构建原核表达载体pET-20b-NS1A和真核表达载体pVAX1-NS1A。pET-20b-NS1A 质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG 诱导表达,表达的融合蛋白带位于30 KDa 处,表达蛋白占菌体蛋白的35%。用纯化后的NS1A 蛋白对青紫蓝兔进行常规免疫,得到较高的多克隆抗体效价(1:25600)。应用脂质体介导转染真核表达载体pVAX1-NS1A 到Hela 细胞系。转染后的HeLa 细胞出现生长抑制并伴有明显的凋亡特征,细胞数量减少,细胞核致密浓染,而且某些细胞出现核仁萎缩,荧光染色增强。本研究在国内首次观察到NS1A 蛋白在Hela 细胞中表达并表现部分活性功能,造成Hela 细胞生长抑制,发生细胞凋亡。

论文目录:

前言

第一篇 文献综述

第一章 流感病毒诱导细胞凋亡的研究进展

第二章 A 型流感病毒NS1A 蛋白的研究进展

第三章 流感病毒非结构蛋白NS1 胞内抗病毒反应研究进展

第二篇 研究内容

第一章 H9N2亚型禽流感病毒非结构蛋白NS1A基因的克隆与序列分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 总RNA 提取

2.2 RT-PCR 扩增结果

2.3 NS1A 重组质粒酶切鉴定

2.4 重组克隆载体pMD-18-T-NS1A 序列测定与分析

3 讨论

3.1 RNA 提取

3.2 RT-PCR 反应

3.3 克隆载体的选择

3.4 阳性物筛选与鉴定

3.5 NS1A 基因克隆方法的选择

3.6 同源性分析

4 小结

第二章 NS1A 在大肠杆菌中的表达及其多克隆抗体的制备

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 重组质粒的酶切

2.2 NS1A 基因在宿主菌中的表达

2.3 包涵体的制备与纯化

2.4 间接ELISA 检测抗体效价

2.5 Western blot 检测

3 讨论

3.1 NS1A 基因在原核系统中的表达

3.2 表达条件的优化

3.3 包涵体的制备与纯化

3.4 多克隆抗血清的制备

3.5 抗体效价及特异性的检测

4 小结

第三章 NS1A 真核表达载体的构建及真核转染对Hela 细胞的影响

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 NS1A 真核表达载体的构建

2.2 NS1A 转染HeLa 细胞系的ELISA 检测

2.3 NS1A 转染HeLa 细胞系的普通光学显微镜观察

2.4 NS1A 转染HeLa 细胞系的细胞计数

2.5 NS1A 转染HeLa 细胞系的MTT 检测

2.6 NS1A 转染HeLa 细胞系的荧光显微镜观察

2.7 NS1A 真核表达产物的Western blot 检测

2.8 NS1A 真核转染HeLa 细胞的流式细胞仪检测

3 讨论

3.1 NS1A 真核表达载体的构建及在HeLa 细胞中的表达

3.2 NS1A 蛋白对HeLa 细胞凋亡的影响

3.3 NS1A 蛋白诱导HeLa 细胞凋亡的可能机制分析

4 小结

结论

参考文献

附录

攻博期间发表的学术论文及其他成果

中文摘要

英文摘要

个人简历

致谢

发布时间: 2005-08-26

参考文献

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