多潜能成体干细胞内皮分化和高糖对内皮分化的影响及相关信号通路机制探讨

论文摘要

(第一章)目的:观察大鼠MAPCs在无外源性生长因子的分化培养条件下向内皮分化过程中细胞形态学,内皮标志物和功能的改变:研究在分化过程中相关生长因子的分泌趋势以及对分化的影响。方法:大鼠MAPCs作为本实验的研究材料,在无外源性生长因子的分化条件下培养。在分化过程中观察细胞形态学改变。Q-RT-PCR检测内皮细胞标志物CD31、Flk1、vWF、VE-cadherin和干细胞标志物oct4在分化过程中mRNA水平的改变。细胞免疫荧光检测相关内皮细胞标志物和干细胞标志物在分化过程中蛋白水平的改变。ELISA检测大鼠MAPCs分化过程中生长因子分泌的变化。Dil-acLDL和Matrigel用于检测分化后细胞的内皮功能。培养基中加入外源性VEGF、VEGF中和抗体和TGFβ1中和抗体,Q-RT-PCR检测相关内皮细胞标志物的改变,研究生长因子对大鼠MAPCs内皮分化的影响。结果:大鼠MAPCs在无外源性生长因子的分化培养条件下,细胞形态逐渐改变,形成梭形和鹅卵石样的椭圆形细胞。同时也表达内皮细胞标志物CD31、Flk1、vWF和VE-cadherin,并且能摄入Dil-acLDL,在Matrigel上形成二维管状结构。分化的细胞还能分泌VEGF和TGFβ1,外源性的VEGF和VEGF中和抗体对大鼠MAPCs的CD31和Flk1表达无影响（P＞0.05）,而TGFβ1中和抗体则在分化第3天显著降低细胞CD31和Flk1的表达（P＜0.05）。结论:我们首次报道了大鼠MAPCs在无外源性生长因子的条件下亦能向内皮细胞分化,其自身能够分泌VEGF（一过性）和TGFβ1（持续性）。我们的研究结果进一步提示:在大鼠MAPCs中,是TGFβ1而不是VEGF在其内皮分化过程起作用。（第二章）目的:观察高糖对大鼠MAPCs凋亡、增殖、内皮细胞分化以及VEGF和TGFβ1分泌的影响,并探讨高糖影响VEGF表达的相关信号通路传导机制。方法:观察高糖对大鼠MAPCs的增殖和凋亡的影响,未分化的细胞在不同浓度的高糖（20、30、40、50mM D-glucose）环境下培养72小时,AnnexinV和PI标记细胞,FACS检测细胞凋亡率;Brdu色度法检测高糖对未分化大鼠MAPCs增殖的影响。大鼠MAPCs在正常（5.5mM D-glucose）、高糖（30mM D-glucose）和高渗（30mM甘露醇）条件下分化,Q-RT-PCR检测相关内皮细胞标志物mRNA的改变。ELISA检测高糖对细胞分泌VEGF和TGFβ1的影响。Western Blotting观察JAK2/STAT3和AKT信号通路在高糖调节VEGF表达和分泌中的作用,以及AG490,一种JAK2特异性磷酸化抑制剂对大鼠MAPCs产生VEGF的影响。细胞免疫荧光观察细胞内VEGF的表达以及高糖对磷酸化STAT3核转移的影响。结果:不同浓度的D-glucose（20、30、40mM）对大鼠MAPCs的增殖无影响（P＞0.05）,而50mM D-glucose能够降低大鼠MAPCs的增殖（P＜0.05）。实验设计中所有浓度D-glucose对大鼠MAPCs的凋亡无影响（P＞0.05）。在分化第1天,与正常组相比,高糖组的VEGF和Flk1表达降低,分化中晚期,VEGF、Flk1和CD31的表达则增高,其中CD31增高的差异有显著性（P＜0.01）。高糖和AG490都能够降低VEGF的mRNA表达和蛋白合成以及降低STAT3的磷酸化水平（P＜0.05）,而高糖对AKT磷酸化无影响（P＞0.05）。同时高糖组的磷酸化STAT3核转移也减少。高糖组的TGFβ1表达与合成都高于正常组（P＜0.05）。结论:高糖对大鼠MAPCs的增殖和凋亡影响不显著:高糖通过降低JAK2/STAT3信号通路的磷酸化水平而抑制VEGF mRNA和蛋白水平的表达;高糖能够促进TGFβ1 mRNA和蛋白水平的表达,可能继而促进内皮细胞标志物的表达。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 引言
• 第一章 大鼠MAPCs培养和内皮分化的研究
• 1. 前言
• 2. 实验材料与仪器
• 3 实验方法
• 3.1 大鼠MAPCs培养
• 3.2 MAPCs内皮分化的研究
• 3.3 大鼠MAPCs分泌生长因子的检测及其在内皮分化中的作用
• 4 实验结果
• 4.1 细胞形态学改变
• 4.2 内皮细胞和干细胞标志物在分化过程中的改变
• 4.3 内皮细胞功能试验
• 4.4 大鼠MAPCs产生VEGF和TGFβ1
• 4.5 VEGF或TGFβ1对大鼠MAPCs内皮分化标志物的影响
• 5. 分析讨论
• 第二章 高糖对大鼠MAPCs的影响
• 1. 前言
• 2. 材料与仪器
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验仪器
• 2.3 实验相关试剂的配制
• 3. 实验方法
• 4. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果