RTN3调节BACE1轴突转运的机制研究

论文摘要

阿茨海默症（Alzheimer’s disease, AD）的病理特征之一是患者脑部的老年斑（Senile plaque）,其中包含淀粉样蛋白斑、活化的星形胶质细胞、激活的小胶质细胞和大量营养不良的神经元。淀粉样蛋白Aβ的沉积形成淀粉样蛋白斑,这种肽段是由其前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）经过β-和γ-secretase两步依次剪切而成。BACE1是唯一在β-位点切割APP的蛋白酶,它起始了Aβ的生成。增加BACE1的活性即会引起Aβ产量的增加,并最终导致AD病人脑中淀粉样蛋白的沉积。因此,在AD患者中BACE1的活性为何会增加,又如何增加,一直是近年来比较热门的研究课题。APP主要在神经元中表达,而人脑中Aβ的沉积与其轴突释放高度相关。所以我们进一步探讨了BACE1的突触定位是如何受到调节的。Reticulon3（RTN3）与BACE1相互作用,抑制其酶活性和对APP的剪切。这种调节功能的机制可能是1)：BACE1酶活性的发挥需要偏酸性的环境,而RTN3与BACE1相互作用后使得后者被滞留在内质网中,无法进去pH相对偏低的细胞器如早期内吞体,从而不能发挥其最大酶活性；2)：RTN3与BACE1的相互作用本身在空间阻碍了BACE1与APP的结合。在本研究中,我们对RNT3是否调节BACE1的突触定位进行研究,并且进一步明确其发生机制。所以本研究的主要目的是：研究在神经元中,BACE1在神经元中的定位和转运方式。更重要的是,了解RTN3对于BACE1的轴突转运和APP剪切的影响。我们的结果显示BACE1不仅分布于晚期高尔基体、转运高尔基体和早期内吞体,还存在于轴突和树突中。我们发现BACE1与突触前蛋白Synaptophysin存在共定位,提示BACE1定位于突触。突触位置的Ap过度释放与淀粉样蛋白沉积的增加有关,所以我们还探讨了BACE1在突触位置的定位是否受到其负向调控蛋白reticulon3（RTN3）的调控。我们发现在原代培养神经元中同时过表达RTN3与BACE1使得BACE1与Synaptophysin和PSD95的共定位下降,且这种下降是由于BACE1的顺式轴突转运被RTN3的过表达抑制。我们的结果说明RTN3的水平可以影响BACE1在轴突中的转运,且调控BACE1的轴突转运可以减少Aβ的轴突末端释放和淀粉样蛋白沉积,因此或可成为阿茨海默症的一条治疗途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 英文缩略词表
• 前言
• 第一章 RTN3和BACE1在神经元中的定位
• 1. 材料与方法
• 1.1 主要仪器
• 1.2 材料与试剂
• 1.3 试剂配置
• 2. 方法
• 2.1 质粒
• 2.2 胎鼠海马神经元的原代培养
• 2.3 胎鼠原代神经元的转染
• 2.4 免疫荧光鉴定原代培养神经元及其极性
• 2.5 BACE1和RTN3在神经元的亚细胞定位
• 3. 结果
• 3.1 胎鼠皮层神经元的原代培养
• 3.2 BACE1在神经元中的定位
• 3.3 RTN3在神经元中的定位
• 3.4 BACE1与RTN3在神经元中的共定位
• 4. 讨论
• 第二章 RTN3调节BACE1在神经元突触上的分布
• 1. 材料与方法
• 1.1 主要仪器
• 1.2 材料与试剂
• 1.3 试剂配置
• 2. 方法
• 2.1 胎鼠海马神经元的原代培养
• 2.2 神经元树突棘的鉴定
• 2.3 轴突上BACE1小点的计数
• 2.4 神经元胞体内BACE1斑块的面积
• 2.5 BACE1与突触标记蛋白的共定位研究
• 3. 结果
• 3.1 原代培养的胎鼠皮层神经元树突棘的鉴定
• 3.2 RTN3在神经突上的分布
• 3.3 BACE1在神经突上的分布
• 3.4 RTN3减少BACE1到突触上的定位
• 3.5 RTN3改变BACE1在胞体和轴突中的量
• 4. 讨论
• 第三章 RTN3改变BACE1的顺式轴突转运
• 1. 材料与方法
• 1.1 主要仪器
• 1.2 材料与试剂
• 1.3 试剂配置
• 2. 方法
• 2.1 胎鼠海马神经元的原代培养
• 2.2 活细胞实时成像
• 2.3 快速轴突转运的波动图分析
• 2.4 轴突转运的速度计算
• 3. 结果
• 3.1 RTN3的过表达影响BACE1的顺式快速轴突转运
• 3.2 RTN3的过表达不影响APP的轴突转运
• 4. 讨论
• 总结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间主要的研究成果
• 致谢