猪轮状病毒NSP4基因原核与真核表达载体的构建及其表达研究

论文摘要

轮状病毒（rotavirus RV）是仔猪腹泻的重要原因,仔猪感染RV后迅速发生腹泻,严重者常因脱水而死亡,给畜牧业造成严重的危害。RV血清型众多,血清的免疫交叉保护性低,研究新型疫苗已经成为防制RV腹泻的研究热点。最近的研究显示轮状病毒非结构蛋白NSP4与RV免疫相关,有可能成为轮状病毒疫苗研制的候选基因。本研究则从猪轮状病毒NSP4着手对其特性进行初步研究,主要内容如下:1.猪轮状病毒NSP4基因的克隆及鉴定根据基因库中已发表的猪轮状病毒OSU株NSP4基因设计含XhoI和EcoRI酶切位点的上、下游引物,并利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从病毒基因组中获得NSP4基因的开放阅读框（ORF）547bp,构建了克隆载体pMD-19T-NSP4。序列分析显示,经过细胞培养的OSU株产生了很大的变异,它与报道的OSU株核苷酸序列同源性为81%,氨基酸同源性为83%,主要变异区段集中在C末端。该毒株更趋向于人轮状病毒,它与人轮状病毒G10株核苷酸同源性为93%,与氨基酸序列同源性为95%。2.NSP4基因片段原核表达载体的构建及其表达研究实验设计了一对引物扩增了去掉前端疏水区的300bp左右的NSP4基因片段,并将其克隆入pMD-19Tsemple载体。然后通过XhoI和EcoRI酶切位点转移到pet32a（+）载体上获得能表达NSP4蛋白C端片段（86-174aa）的原核表达载体pet32a-NSP4c。利用原核表达并纯化的NSP4c蛋白和免疫小鼠获得的阳性抗体构建了检测NSP4抗体的间接ELISA方法。3.NSP4基因真核表达载体的构建及其表达研究将NSP4基因片段通过XhoI和EcoRI酶切位点转移到pEGFP-N1载体上构建真核表达重组质粒pEGFP-N1-NSP4。随后采用脂质体转染法将pEGFP-N1-NSP4转染至COS7细胞。该载体含有绿色荧光蛋白,因此直接用荧光倒置显微镜检测了NSP4基因的表达情况。将昆明小鼠分成随机3组。第一、二组为空白对照和空载体对照,分别注射生理盐水（100μl/只）,pEGFP-N1（100μg/只）。第三组为实验组,注射pEGFP-N1-NSP4（100μg/只）。每两周免疫一次,共免疫三次。分别在免疫的第0d、14d、21d、28d、35d和42d采血制备血清,用ELISA检测抗体水平。第21d即可检测出抗NSP4阳性抗体,第28d、35d阳性抗体水平增加,第42d抗体水平下降。实验结果表明,重组真核表达载体pEGFP-N1-NSP4进行动物免疫时在细胞内得到了表达,并且表达产物能诱导体液免疫反应产生抗体。该试验为NSP4结构和功能的研究以及轮状病毒DNA疫苗的研究提供了材料和技术基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1.轮状病毒病概述
• 2.轮状病毒概述
• 3.轮状病毒疫苗研究
• 3.1 传统疫苗
• 3.2 亚单位疫苗
• 3.3 DNA疫苗
• 3.4 猪轮状病毒疫苗研究
• 4.轮状病毒的检测
• 5.轮状病毒蛋白的研究
• 5.1 结构蛋白
• 5.2 非结构蛋白
• 6.目的意义
• 1.材料
• 1.1 生物材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2.方法
• 2.1 NSP4基因的克隆及鉴定
• 2.1.1 PRV病毒的增殖
• 2.1.2 引物设计
• 2.1.3 NSP4基因的扩增及回收
• 2.1.4 NSP4的克隆及鉴定
• 2.2 NSP4基因原核表达载体的构建及其表达研究
• 2.2.1 NSP4c的克隆与鉴定
• 2.2.2 重组质粒pet32a-NSP4c的构建及其鉴定
• 2.2.3 重组质粒pet32a-NSP4c的诱导表达
• 2.2.4 NSP4c蛋白的纯化
• 2.2.5 间接ELISA的构建
• 2.3 NSP4基因真核表达载体的构建及其表达研究
• 2.3.1 目的基因的酶切及纯化
• 2.3.2 连接与转化
• 2.3.3 重组阳性转化子的鉴定
• 2.3.4 NSP4基因在COS7细胞中的表达
• 2.3.5 pEGFP-N1-NSP4质粒的大量制备与提纯
• 2.3.6 pEGFP-N1-NSP4免疫抗体检测
• 3.实验结果
• 3.1 NSP4基因的克隆及鉴定
• 3.1.1 RT-PCR结果
• 3.1.2 重组质粒pMD-19T-NSP4的鉴定
• 3.1.3 NSP4基因序列测定与分析
• 3.2 NSP4c基因原核表达载体的构建及其表达研究
• 3.2.1 NSP4c PCR结果
• 3.2.2 重组质粒pMD-19T-NSP4c的鉴定
• 3.2.3 重组质粒pet32a-NSP4c的鉴定
• 3.2.4 重组质粒pet32a-NSP4c的诱导表达
• 3.2.5 NSP4c融合蛋白的纯化
• 3.3 NSP4基因真核表达载体的构建及其表达研究
• 3.3.1 重组质粒pEGFP-N1-NSP4的鉴定
• 3.3.2 NSP4基因在COS7细胞中的表达鉴定
• 3.3.3 pEGFP-N1-NSP4免疫抗体检测
• 4.讨论
• 4.1 NSP4基因的克隆
• 4.1.1 NSP4基因的RT-PCR
• 4.1.2 NSP4基因的克隆及序列分析
• 4.2 NSP4c基因的原核表达
• 4.3 NSP4基因的真核表达
• 4.3.1 真核表达载体的构建
• 4.3.2 pEGFP-N1-NSP4免疫原性分析
• 5.结论
• 参考文献
• 致谢
• 实验试剂的配置