无载体骨架无选择标记玉米转化体系的优化

论文摘要

植物转基因技术的研究和新产品的开发已取得了突破性进展,在解决人类面临的环境污染、资源短缺等问题显示出巨大的作用。但是,近年来随着人们对生物安全性的关注,载体骨架序列和选择标记基因作为“垃圾DNA”影响着转基因植物的安全性评价。因此,建立无载体骨架无选择标记的转基因技术已成为植物基因工程领域的研究热点。虽然花粉管通道法可以将线性DNA片段导入植物基因组,直接获得无载体骨架无选择标记的转基因植株,但其转化率和可重复性有待提高。玉米是重要的粮食兼饲料作物,在我国农业生产中占有非常重要的地位。本研究以玉米为试材,在花粉管通道法基础上建立并优化了子房滴注转化方法,其操作要点是将DNA转化溶液直接滴加在完全去除花柱的子房上。首先通过苯胺兰染色观察花粉管确定转化操作开始时间为授粉后16 h,然后利用子房滴注法转化无载体骨架无选择标记的线性GFP基因转化元件（GFP基因表达框两侧分别包含25bp T-DNA左右边界序列）。对FITC标记的线性转化元件进行显微观察和示踪,结果表明子房滴注法与花粉管通道法相比,缩短了外源DNA进入胚囊的路径和时间;转化缓冲液0.05%Silwet L-77+5%sucrose缩短了外源DNA进入胚囊的时间并加大进入量。通过PCR检测,确定适合子房滴注法转化的玉米品种为9818,最佳转化时间为授粉后18～20 h,最佳转化缓冲液成分为0.05%Silwet L-77+5%sucrose,在此条件下PCR阳性率达到6.47%。本研究进一步对线性GFP基因转化元件在转基因植物基因组中的整合方式、拷贝数、表达情况和后代遗传规律进行了分析。Southern blot结果表明GFP基因以低拷贝数、简单的方式（1～3条Southern杂交带）整合到玉米基因组;Northern blot结果表明GFP基因在转录水平上表达;在转基因植株的根和幼胚中观察到GFP表达;转基因植株的后代遗传分析表明GFP基因能够遗传至T2代并正常表达,部分转基因株系中的GFP基因以孟德尔遗传方式传递给T1代,但T2代不符合孟德尔分离比。为了验证玉米子房滴注法的可重复性,本研究将分别包含T-DNA边界和LKR/SDH（lysine-ketoglutarate reductase/saccharopine dehydrogenase）边界的线性GUS基因转化元件（LKR/SDH基因5’端部分序列-CaMV35S-GUS基因-nos-LKR/SDH基因3’端部分序列）转化玉米,PCR阳性率分别为7.2%和11.5%。结果表明,玉米来源的LKR/SDH基因部分序列作为线性转化元件的边界可提高转化率;子房滴注法由于规范了操作要点、确定了最佳转化时间和转化缓冲液而具有较高的转化率和良好的重复性。对包含LKR/SDH边界的线性GUS基因转化元件在转基因植物中的整合、表达和遗传规律也进行了分析,Southern blot结果表明GUS基因以简单的方式（1～2条Southern杂交带）整合到玉米基因组;RT-PCR结果表明GUS基因在转录水平上表达;组织化学染色结果表明GUS基因在转基因植株的根、叶和幼胚中正常表达;对4个T1代转基因株系的组织化学染色和PCR检测结果表明,GUS基因以孟德尔分离方式遗传并正常表达。由于子房滴注法的转化率受到不同玉米品种子房外部形态的影响,为了完善无载体骨架无选择标记的玉米遗传转化体系,本研究利用花粉管通道法转化线性GFP基因转化元件,并建立了简便、高效的检测方法。首先确定玉米花粉管通道法的操作要点:授粉后17～18 h,与穗轴顶部相齐切掉花柱和苞叶,将转化元件溶液滴加在花柱上。通过观察GFP在幼胚中的表达确定花粉管通道法的转化部位（籽粒位于玉米果穗的5～8圈）;然后利用PCR检测和观察GFP表达从位于转化部位的籽粒中筛选转基因植株,检出率提高到4.96%,并进一步验证了花粉管通道法的转化部位;Southern blot结果表明GFP基因以简单的方式整合到玉米基因组;Northern blot结果表明GFP基因在转录水平上表达。本研究建立了具有较高转化率的子房滴注转化法和适用于花粉管通道转化的简便、高效的检测方法,这两种方法互相补充,初步完善了无载体骨架无选择标记的玉米遗传转化体系。通过分析外源基因的整合方式、拷贝数、表达情况和后代遗传规律,为子房滴注法在生产实践中的广泛应用提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 转基因植物的优越性及其生物安全性探讨
• 1.1.1 转基因植物的优越性
• 1.1.2 转基因植物的发展前景
• 1.1.3 转基因植物的生物安全性争论
• 1.1.4 引发转基因植物安全性的因素及解决对策
• 1.1.4.1 载体骨架序列整合到植物染色体中的现象及安全性隐患
• 1.1.4.2 解决载体骨架序列问题的策略
• 1.1.4.3 选择标记基因的安全性隐患及解决策略
• 1.1.4.4 直接获得无载体骨架无选择标记的转基因植株
• 1.2 花粉管通道转基因技术研究进展
• 1.2.1 外源DNA直接导入受体植物技术的理论依据
• 1.2.2 花粉管通道法的提出及发展
• 1.2.3 花粉管通道法的细胞胚胎学机理探讨
• 1.2.4 花粉管通道法存在的问题和解决思路
• 1.3 外源基因在转基因植物中的整合及遗传特性
• 1.3.1 外源基因在转基因植物中整合方式的多样性
• 1.3.2 外源基因在转基因植物中的遗传多样性
• 1.3.2.1 单位点整合孟德尔遗传
• 1.3.2.2 多位点整合孟德尔遗传
• 1.3.2.3 非孟德尔遗传
• 1.3.3 探索植物转基因新方法对外源基因整合、表达和遗传的影响
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 玉米子房滴注转化方法的建立与优化
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验仪器
• 2.1.2 商品试剂
• 2.1.3 配制试剂
• 2.1.4 试验材料
• 2.1.5 引物设计与合成
• 2.1.5.1 制备线性转化元件所用引物
• 2.1.5.2 转化材料检测所用引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 线性GFP基因转化元件的制备
• 2.2.2 苯胺兰染色观察花粉管
• 2.2.3 转化方法
• 2.2.4 外源DNA转化后的显微观察和示踪
• 2.2.5 转化材料的PCR检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 线性转化元件的制备
• 2.3.2 苯胺兰染色观察花粉管
• 2.3.3 玉米子房滴注法的建立与优化
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3 线性转化元件在转基因植株中的整合、表达及遗传分析
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 试验仪器
• 3.1.3 商品试剂
• 3.1.4 配制试剂
• 3.1.5 引物设计与合成
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 狭缝杂交检测
• 3.2.2 Southern blot检测
• 3.2.3 RT-PCR检测
• 3.2.4 Northern blot检测
• 3.2.5 转基因植株GFP表达检测
• 3.2.6 转基因植株后代遗传分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 狭缝杂交检测
• 3.3.2 转基因植株的Southern blot检测
• 3.3.3 RT-PCR检测
• 3.3.4 转基因植株的Northern blot检测
• 3.3.5 GFP表达
• 3.3.6 转基因植株后代遗传分析
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 4 子房滴注法转化线性GUS基因转化元件
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 植物材料和质粒
• 4.1.2 试验仪器
• 4.1.3 商品试剂
• 4.1.4 配制试剂
• 4.1.5 引物设计与合成
• 4.1.5.1 制备线性转化元件所用引物
• 4.1.5.2 转化材料检测所用引物
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 线性GUS基因转化元件的制备
• 4.2.2 子房滴注法转化线性GUS基因转化元件
• 4.2.3 转化材料的PCR检测
• 4.2.4 Southern blot检测
• 4.2.5 RT-PCR检测
• 4.2.6 组织化学染色检测GUS表达
• 4.2.7 转基因植株后代遗传分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 线性转化元件的制备
• 4.3.2 转化材料的PCR检测
• 4.3.3 狭缝杂交检测
• 4.3.4 转基因植株的Southern blot检测
• 4.3.5 RT-PCR检测
• 4.3.6 GUS表达
• 4.3.7 转基因植株后代遗传分析
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 5 花粉管通道法转化线性GFP转化元件及简便、高效检测方法的建立
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 植物材料和质粒
• 5.1.2 试验仪器
• 5.1.3 商品试剂
• 5.1.4 配制试剂
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 花粉管通道法转化线性GFP基因转化元件
• 5.2.2 花粉管通道法转化部位的初步确定
• 5.2.3 转基因植株筛选
• 5.2.4 Southern blot检测
• 5.2.5 Northern blot检测
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 花粉管通道法转化部位的初步确定
• 5.3.2 转基因植株的筛选
• 5.3.3 转基因植株的Southern blot检测
• 5.3.4 转基因植株的Northern blot检测
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 6 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 创新点摘要
• 6.3 有待进一步开展的工作
• 6.4 展望
• 参考文献
• 附录Ⅰ 缩略语
• 附录Ⅱ 论文中所用的DNA Marker
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 致谢
• 个人简介