基于人脂多糖结合蛋白和聚羟基脂肪酸结合蛋白PhaP的内毒素去除方法

论文摘要

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外壁中的特有结构,是其在生长、分裂或死亡过程中释放到环境中的有毒物质。内毒素分子化学性质非常稳定,并且在水溶液中易聚合成不同分子量的聚合物,使得生物制品中内毒素的去除变得非常困难。聚羟基脂肪酸酯（PHA）颗粒结合蛋白质（PhaP）对PHA以及其它疏水性聚酯具有较强的亲和力。人脂多糖结合蛋白（hLBP）是人体血浆内自然存在的内毒素受体。在本论文研究中,融合蛋白rhLBP–PhaP基因在毕赤酵母GS115中分泌表达。收集到的融合蛋白通过PhaP锚定在PHB颗粒表面,用于水和蛋白质溶液中内毒素的去除研究。牛血清白蛋白（BSA）溶液,卵清蛋白（ovalbumin）溶液,胰凝乳蛋白酶原（basic proteinα-chymotrypsinogen）溶液三种蛋白质溶液作为模式被使用,用于研究蛋白质溶液中内毒素的去除效率和蛋白质的回收率,以及离子强度和酸碱度对去除效果的影响。结果表明:本论文研究制作的亲和颗粒（rhLBP- PhaP-PHB颗粒）的内毒素去除率可达90%以上,并且内毒素的去除率和蛋白质的回收率几乎不受离子强度的影响,但是酸碱度对其有一定的影响。我们的研究结果表明,基于rhLBP- PhaP-PHB颗粒的内毒素去除系统,具有准备简单,无毒和高效的特点,非常适合蛋白质纯化工艺中内毒素的去除。

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论文中重要的缩略词

第1章前言

1.1 内毒素（endotoxins,ET）概述

1.2 内毒素的检测

1.2.1 家兔热原实验法（Rabbit Pyrogenic Test,RT）

1.2.2 鲎实验法（Limulus Test,LT）

1.2.3 其它检测方法

1.3 内毒素的去除方法

1.3.1 超滤法和荷电微孔滤膜法

1.3.2 石棉及活性炭吸附法

1.3.3 化学降解法

1.3.4 相分离法

1.3.5 离子交换色谱法

1.3.6 亲和色谱法

1.4 聚羟基脂肪酸酯（PHA）概述

1.4.1 PHA的单体组成和分类

1.4.2 PHA的生理功能

1.4.3 PHA的材料学性质

1.4.4 PHA的应用

1.5 PHA的生物合成途径

1.5.1 乙酰辅酶A直接合成PHB途径

1.5.2 脂肪酸从头合成途径

1.5.3 脂肪酸β-氧化途径

1.6 PHA代谢相关的酶和蛋白质

1.6.1 PHA聚合酶（PhaC）

1.6.2 PHA颗粒结合蛋白（PhaP）

1.6.3 乙酰乙酰辅酶A还原酶（PhaB）

1.6.4 （R）-3-羟基脂酰-ACP:CoA酰基转移酶（PhaG）

1.6.5 R-特异的烯脂酰辅酶A水合酶（PhaJ）

1.6.6 PHA解聚酶（depolymerase, PhaZ）

1.7 脂多糖结合蛋白简介

1.8 前景展望

1.9 论文的目的及其意义

第2章实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌种和质粒

2.1.2 分子生物学常用的工具酶和试剂盒

2.1.3 常用生化试剂

2.1.4 分子量标准物

2.1.5 聚合酶链式反应（PCR）用试剂

2.1.6 仪器和设备

2.2 常规实验方法

2.2.1 菌种保存方法

2.2.2 常用培养基的配制

2.2.3 常用溶液及缓冲液的配制

2.2.4 分子生物学常规操作

2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

2.2.6 蛋白质含量的测定

2.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

2.3 溶液中内毒素去除研究方法

2.3.1 PHB纳米颗粒的制作

2.3.2 酵母表达质粒pGAPHLBP的构建

2.3.3 PCR和酶切验证表达载体构建

2.3.4 Pichia Pastoris GS115 的转化及重组子筛选

2.3.5 Western blot分析酵母重组菌中目的蛋白的表达

2.3.6 融合蛋白和PHB颗粒结合构建的亲和粒子与内毒素的结合

2.3.7 蛋白质溶液中内毒素的去除效率和目的产物的回收率

第3章结果与分析

3.1 融合蛋白和PHB颗粒结合构建的亲和粒子与内毒素的结合

3.2 酵母表达质粒pGAPHLBP的构建和验证

3.3 Pichia Pastoris GS115 的转化及重组子筛选

3.3.1 毕赤酵母重组子的筛选

3.3.2 Western blot分析酵母重组菌中目的蛋白的表达

3.4 蛋白质溶液中内毒素的去除效率和目的产物的回收率

第4章结论

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

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