定心方防治心肌缺血再灌注心律失常的机制研究

论文摘要

一、目的随着冠脉介入术、搭桥术、经皮穿刺冠状动脉内成形术、内科溶栓等疗法在冠心病患者中的广泛应用,冠状动脉再通后的再灌注损伤日益成为临床上突出的问题。缺血后的再灌注损伤已经成为阻碍缺血心肌从血液再灌注中获得及时、有效疗效的最大障碍。心律失常是缺血再灌注损伤最主要的临床表现,有时严重的室性心律失常还危及生命。因此,探讨缺血再灌注损伤心律失常的病理机制及研究有效的防治药物意义重大。中医药防治缺血再灌注心律失常具有多层次、多角度、多靶点的特征,包括清除氧自由基、抑制钙超载、对一氧化氮的影响、对交感神经的影响等途径。这充分显示了中医药在防治缺血再灌注损伤及其心律失常方面有广阔的前景。本研究采用大鼠冠状动脉左前降支结扎再松开的方法复制缺血再灌注心律失常动物模型,用中药复方定心方对其进行干预,研究定心方对缺血再灌注心律失常心肌细胞凋亡、心肌组织NF-κB和caspase-3表达的影响,同时利用蛋白质组技术初步探讨缺血再灌注心律失常动物模型的心肌蛋白质组表达谱及定心方对其的影响,以更深层次地揭示定心方防治缺血再灌注心律失常的机制,为研制开发防治缺血再灌注心律失常的有效药物奠定基础。二、方法雄性Wistar大鼠随机分成3组,每组10只:假手术组（SH）、再灌注组（I/R）、定心方组（DXR）。在蛋白质组实验中DXR组根据有无出现心律失常又分为未出现心律失常组（DXRN）和出现心律失常组（DXRY）。所有动物均适应性喂养两天。SH组大鼠每天分上午及下午两次灌服生理盐水,于第8天进行假手术,即进行冠脉穿线但不结扎;I/R组大鼠亦分上午及下午两次灌服生理盐水,于第8天进行手术造模;DXR组大鼠分上午及下午两次灌服制备好的定心方药液,于第8天进行手术造模。灌胃量均按大鼠体重计算,每次1ml/100g。造模方法根据经典的《药理实验方法学》“麻醉大鼠冠脉结扎和再灌注诱发心律失常法”,连接心电图机和心电示波器,观察心律失常的发生,详细记录再灌注期间的心律失常,并进行室性心律失常的量化评分。造模结束后直接取出心脏,放入冰生理盐水中冲洗,分离左心室部分,并将其再分成两部分,一部分直接放入10%中性福尔马林溶液中固定,一部分放入-80℃冰箱中保存。福尔马林溶液固定后的心肌组织常规石蜡包埋、切片。常规HE染色观察缺血再灌注心律失常时的心肌组织形态及定心方对其的保护作用。采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡,观察定心方对缺血再灌注心律失常心肌细胞凋亡的影响。采用SABC免疫组化法分别检测心肌NF-κB、caspase-3的表达,观察定心方对缺血再灌注心律失常大鼠心肌NF-κB、caspase-3表达的影响。冰箱保存的心肌组织用组织裂解液提取心肌总蛋白,采用Bradford法进行心肌蛋白的定量。采用蛋白质组最核心的双向电泳技术分离心肌总蛋白,一向采用IPG3-10L、24cm凝胶条进行水平的等电聚焦,二向进行SDS-PAGE垂直电泳。电泳结束后采用硝酸银染色法进行凝胶染色,利用凝胶成像仪采集图像。采用Image MasterTM 2D platinum version5.0进行图像分析,包括蛋白点检测、修正、背景消减、分子量和等电点的校正。以模型组心肌组织蛋白的凝胶图像作为参考胶,其他各组与之匹配,采用软件自动匹配并结合人工匹配方式进行。设定表达量相差2倍以上为差异表达范围,软件自动进行分析,给出差异表达蛋白质点的数据信息。搜索网上RAT HEART-2DEPAGE数据库的所有已鉴定蛋白点,与本实验差异蛋白点进行对比分析（设定误差范围为:PI为±0.2,MW为±1kDa）,对本实验的部分蛋白质点进行初步的相似性鉴定,为以后的质谱鉴定提供参考。三、结果（一）定心方对缺血再灌注心律失常大鼠心律失常的影响。本实验的造模方法可以较好地制作出心律失常模型,定心方对模型大鼠具有良好的保护作用。SH组大鼠偶见室性早搏,未见其他心律失常;I/R组大鼠10例均发生心律失常,以频发室早、室速、室颤等为主,还有少量的房室传导阻滞,其中2例因室颤死亡,室性心律失常评分与SH组比较增高;DXR组有7例出现心律失常,以室早和室速为主,室性心律失常评分与I/R组相比降低。经统计学检验,各组心律失常发生率之间具有显著性差异（P＜0.05）;各组心律失常评分也具有显著性差异（P＜0.01）,其分值由高到低依次为I/R组、DXR组、SH组。（二）定心方对缺血再灌注心律失常大鼠心肌组织结构有良好的保护作用。HE染色光镜观察见:SH组大鼠心肌细胞排列整齐,着色均匀,胞膜完整,无变性、坏死等改变;I/R组大鼠心肌细胞排列紊乱,着色不均匀,部分区域心肌细胞浊肿;DXR组大鼠亦有心肌细胞变性与坏死改变,但程度较轻,着色相对均匀,水肿变性减轻,心肌坏死范围较小。（三）定心方对缺血再灌注心律失常大鼠心肌细胞凋亡的影响。SH组大鼠心肌组织有较少量的细胞凋亡。I/R组大鼠心肌细胞凋亡指数比SH组增高,两组比较具有显著性差异（P＜0.01）。DXR组大鼠心肌细胞凋亡指数比I/R组下降,两组比较具有显著性差异（P＜0.01）。（四）定心方对缺血再灌注心律失常大鼠心肌组织caspase-3和NF-κB表达的影响。SH大鼠心肌组织有较少量的caspase-3和NF-κB的表达。I/R组大鼠心肌组织中caspase-3和NF-κB的表达比SH组显著上调,两组比较具有显著性差异（P＜0.01）。DXR组大鼠心肌组织caspase-3和NF-κB的表达低于I/R组,两组比较具有显著性差异（P＜0.01）。（五）缺血再灌注心律失常大鼠心肌蛋白质组表达谱及定心方对其的干预作用。各实验组心肌蛋白质组经双向凝胶电泳及银染后能获得751±36个蛋白点,大多数蛋白点集中在PH4-7和分子量20-80KD之间的区域。以I/R组为参考,各组与之匹配,匹配率为81%±4.3%。图像分析后可发现部分蛋白质在动物造模及定心方作用后发生了明显的质或量的改变。其中,SH组与I/R组比较,共有33个蛋白点变化;DXRN组与I/R组比较,共有36个蛋白点变化;DXRY组与I/R组比较,共有11个蛋白点变化。搜索网上RAT HEART-2DEPAGE数据库的所有已鉴定蛋白点,与本实验差异蛋白点进行对比分析（设定误差范围为:PI为±0.2,MW为±1kDa）,经相似性搜索,初步鉴定了5个蛋白点。SSP1833、SSP2079、SSP2211、SSP545、SSP1766分别为Fructose-bisphosphate aldolase（果糖二磷酸醛缩酶）、ATP synthase alpha chain（ATP合酶α链）、Creatine kinase Mchain（肌酸激酶M链）、Myosin heavy chain1（肌球蛋白重链1）、Alpha-actin 2（α-肌动蛋白2）。以上这些差异蛋白质点可能在缺血再灌注心律失常发生及定心方防治过程中具有重要的意义。四、结论（一）大鼠缺血再灌注损伤容易诱发心律失常,定心方可以明显减少心律失常的发生率,减轻心律失常发生的严重程度。（二）定心方对大鼠心肌缺血再灌注心律失常心肌组织结构具有良好的保护作用。（三）大鼠心肌缺血再灌注心律失常时心肌细胞凋亡明显增加,定心方可以减少心肌细胞凋亡的发生。（四）大鼠心肌缺血再灌注心律失常时心肌组织caspase-3和NF-κB表达明显增多,定心方可以明显减少其表达。（五）大鼠心肌缺血再灌注心律失常时心肌蛋白质组表达谱有明显改变,定心方干预后也有部分蛋白质发生了质和量的改变。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 前言
• 第一章 定心方对大鼠 MI/R心律失常及对心肌组织结构的影响
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 溶液配制
• 1.1.5 实验药物
• 1.2 方法
• 1.2.1 动物模型的制作
• 1.2.2 定心方药液的制备
• 1.2.3 动物分组及处理
• 1.2.4 室性心律失常（VA）的评分
• 1.2.5 心肌组织石蜡切片的制备
• 1.2.6 心肌组织病理学检查
• 1.2.7 统计学处理
• 1.3 结果
• 1.3.1 定心方对模型大鼠心律失常的影响
• 1.3.2 心肌组织病理学观察
• 1.4 讨论
• 第二章 定心方对大鼠 MI/R心律失常心肌细胞凋亡的影响及其机制探讨
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验样本
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 分析软件
• 2.1.5 溶液配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 TUNEL法检测心肌细胞凋亡
• 2.2.2 SABC免疫组化法检测心肌caspase-3的表达
• 2.2.3 SABC免疫组化法检测心肌NF-κB的表达
• 2.2.4 统计学处理
• 2.3 结果
• 2.3.1 心肌细胞凋亡观察结果
• 2.3.2 心肌caspase-3和 NF-κB的表达
• 2.3.3 NF-κB与凋亡指数、caspase-3的相关性分析
• 2.4 讨论
• 第三章 定心方防治大鼠 MI/R心律失常的心肌蛋白质组初步研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验样本
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 分析软件
• 3.1.5 溶液配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 心肌蛋白的提取
• 3.2.2 心肌蛋白的定量
• 3.2.3 标本预处理
• 3.2.4 双向凝胶电泳
• 3.2.5 网上2-DE数据库的搜索
• 3.2.6 统计学处理
• 3.3 结果
• 3.3.1 蛋白浓度定量结果
• 3.3.2 双向凝胶电泳图谱分析
• 3.3.3 心肌蛋白质组差异表达分析
• 3.3.4 网上数据库的搜索
• 3.4 讨论
• 全文总结
• 研究展望
• 参考文献
• 附录一: 缩略词
• 附录二: 实验图谱
• 攻读硕士学位期间成果
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审稿证明