肾脏联合睾丸支持细胞共同移植减轻肾移植术后免疫排斥反应的研究

论文摘要

肾移植的试验研究开创于本世纪初,1936年前苏联Voronoy首次开展了人类同种肾移植,国内从1956年开展了肾移植的动物试验,1960年吴阶平等首先开展尸肾移植。现今肾移植动物模型已完善,全国肾移植临床技术已较成熟,在器官移植中手术例数最多,死亡率最低。但术后病人仍需使用全身免疫抑制剂来控制免疫排斥反应。这些治疗方案存在以下缺点:1)全身毒副作用大;2)剂量难以掌握;3)费用昂贵等。近年来研究发现睾丸支持细胞通过Fas/Fas-L途径而具有免疫豁免作用,将睾丸支持细胞与肾脏共同移植以观察其免疫豁免作用研究是一个新的设想和尝试。文献检索结果显示:目前尚无睾丸支持细胞与肾脏共同移植的动物实验报道。本实验利用睾丸支持细胞的免疫豁免机制,在移植肾的包膜下同时植入睾丸组织及体外原代培养的同供体睾丸支持细胞,用组织切片法观察移植物的存活情况。从而观察睾丸支持细胞降低肾移植术后免疫排斥反应的作用。本实验可为降低临床肾移植免疫排斥反应的发生提供新的思路。目前肾移植术后免疫排斥反应机制已较明确,主要为T细胞及抗体介导的排斥反应,并以前者为主。杀伤性T细胞（CTL）主要通过两种途径来攻击靶细胞,其一是通过释放Fas-L诱导表面有Fas的靶细胞进入凋亡,另一种是依赖于穿孔素传递杀伤因子。Oliver等人用肾移植病人活检肾标本对以上两种途径进行研究,发现在速发排斥、迟发排斥、不排斥病例中,穿孔素-颗粒酶途径主要在急性期反应发现,Fas/Fas-L急慢性都有作用,且以Fas/Fas-L为主要途径。有研究表明T细胞自身的调亡也是通过Fas/Fas-L途径实现的。自从在1989和1993年分别发现Fas受体（Fas,即APO-1,又称CD95）﹑Fas配体（Fas-L）后,国内外学者进行了大量有关该方面的研究。1)Fas-L与Fas分别属于肿瘤坏死因子（TNF）及TNF受体（TNFR）家族,是以膜分子或可溶性分子形式存在于哺乳类机体细胞表面的介导凋亡的蛋白质分子。2)Fas的分布较广泛,许多组织和细胞系低表达Fas,而活性成熟淋巴细胞及鼠睾丸生精细胞等是高表达。Fas-L以往研究认为在各种细胞系中,只有活性T细胞表达Fas-L,而鼠睾丸细胞中意外发现大量Fas-L。3)Fas/Fas-L的免疫下调作用:有研究表明T细胞自身的调亡也是通过Fas/Fas-L途径实现的。4)Fas-L免疫耐受机制:一些肿瘤细胞表达Fas-L,Fas-L可作用于周围Fas阳性T细胞,使之凋亡而使瘤细胞产生免疫逃避。有研究表明Fas-L还可杀伤B细胞和清除中性粒细胞﹑单核细胞。Fas-L免疫耐受机制的认识不但对肿瘤免疫研究扩展了视野,同时对器官移植也有重大作用。由于Fas-L的免疫逃避作用及睾丸的天然持续高表达,使睾丸的免疫豁免作用成为近年的研究热点。大量研究表明:1)鼠（除gld小鼠）睾丸支持细胞（sertoli细胞）高表达Fas-L,生精细胞高表达Fas。睾丸组织是由生精细胞（germ细胞）﹑支持细胞（sertoli细胞）及间质细胞（leydig细胞）构成。在睾丸的正常发育过程中,sertoli细胞是通过Fas/Fas-L途径来限制germ细胞的数量以便其发挥正常的营养支持功能。近年来,国外研究者把大鼠的睾丸细胞分离培养,发现sertoli细胞对germ细胞仍有强烈的杀伤抑制作用,结论睾丸免疫耐受的产生不依赖于睾丸的解剖结构,而是通过Fas/Fas-L的分子介导。2)sertoli细胞主要是通过可溶态的Fas-L（sFas-L）来发挥其功能的,即说明sertoli细胞对远处靶细胞有作用。而且sertoli细胞的作用强烈,在实验中一个sertoli细胞可引起大量的germ细胞死亡,该现象再次说明sertoli细胞主要是通过sFas-L发挥远处杀伤作用。3) sertoli细胞能吸引炎性细胞浸润,并且可杀伤T细胞﹑B细胞及中性粒细胞﹑单核细胞。4)在动物实验中,鼠类的睾丸移植可生存很长时间。90年代中期开始有学者把富含sertoli细胞的睾丸组织块移植到普通部位存活60天以上,证明sertoli细胞确实有免疫豁免作用。近年来对睾丸sertoli细胞的免疫豁免作用机制的研究简单总结如下:1)通过释放sFas-L杀伤淋巴细胞及中性细胞;2)通过细胞间接触经Fas/Fas-L途径杀伤淋巴细胞;3)sertoli细胞吸引炎性细胞浸润,可使联合移植物免受攻击。本实验主要是利用sertoli细胞的免疫豁免机制,首次尝试在大鼠移植肾的包膜下植入睾丸组织及体外原代培养的同供体的sertoli细胞,以观察其免疫豁免作用。目的:通过睾丸支持细胞的共同移植使肾移植的免疫排斥反应降低,利用动物试验进一步证实该细胞的免疫豁免作用,从而为降低临床肾移植免疫排斥反应的发生提供新的思路。方法:利用睾丸支持细胞的免疫豁免机制,在移植肾的包膜下同时植入睾丸组织及体外原代培养的同供体睾丸支持细胞（受体﹑供体动物选材均为SD大鼠）,以观察肾移植术后的免疫排斥反应。本实验首次应用动物肾移植模型观察睾丸支持细胞的免疫豁免作用。取16～22天的雄性大鼠,去除睾丸被膜,剪碎后进行分离,观察细胞生长情况。采用透射电镜及Feulgen染色鉴定睾丸支持细胞。确定体外培养的细胞为睾丸支持细胞后,对体外培养的睾丸支持细胞实施Brdu标记,免疫荧光染色法观察Fas-L表达情况,MTT法确定睾丸支持细胞最佳免疫抑制数量。使用肾血管端端吻合法及输尿管-膀胱抗返流吻合法建立大鼠急性排斥反应模型。在移植肾脏包膜下植入SD大鼠睾丸支持细胞及SD大鼠睾丸组织,观察大鼠移植肾排斥反应及检测大鼠血肌酐及尿素氮变化。结果:1.睾丸支持细胞分离:采用改良方法分离的睾丸支持细胞纯度达到80%以上。2.Brdu标记的睾丸支持细胞占培养细胞总数的75%以上。3.免疫组化染色提示睾丸支持细胞强烈表达Fas-L,。4.MTT法测定最佳免疫抑制细胞数为1×106/L。5.原位肾移植法建立大鼠肾移植模型。该模型较稳定,能够为研究肾移植提供稳定的模型。6.在移植肾被膜下植入睾丸组织及睾丸支持细胞均可使大鼠移植肾功能明显好于对照组,表现为血肌酐水平降低及大鼠存活时间延长。病理组织学观察表明,移植大鼠睾丸组织及睾丸支持细胞均可使移植接触部位的病理改变明显轻于对照组。结论:采用改良方法分离出的大鼠睾丸支持细胞强烈表达Fas-L,在细胞培养过程中使用Brdu标记能够很好的标记培养的细胞,为跟踪植入的细入打下了较好的基础。原位大鼠肾脏模型的建立提高了大鼠肾移植模型建立的成功率。在大鼠移植肾包膜下植入原代培养的睾丸支持细胞及大鼠睾丸组织均能够减少移植肾排斥反应的发生。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言和文献回顾
• 正文
• 一、SD 大鼠睾丸支持细胞的分离、原代培养及鉴定
• 1 实验材料和实验方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验动物及试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 2 试验方法
• 2.1 SD 大鼠睾丸支持细胞的原代培养
• 2.2 睾丸支持细胞的分离与纯化
• 2.3 形态学观察
• 2.4 睾丸支持细胞的鉴定
• 2.5 Sertoli 细胞体杀伤活化淋巴细胞
• 2.6 透射电子显微镜观察
• 2.7 生长曲线及群体倍增时间
• 2.8 免疫细胞化学法鉴定细胞表型特性
• 2.9 睾丸支持细胞的 Brdu 标记
• 2.10 Brdu 标记的免疫组化染色方法
• 2.11 统计分析
• 3 实验结果
• 3.1 睾丸支持细胞的分离
• 3.2 睾丸支持细胞的鉴定
• 3.3 睾丸支持细胞 Fas-L 染色
• 3.4 Brdu 标记率分析
• 3.5 生长曲线和群体倍增时间
• 3.6 支持细胞对脾细胞增殖的抑制作用
• 4 分析和讨论
• 5 附录
• 二、大鼠原位肾脏移植模型的建立
• 1 实验材料和实验方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要仪器与设备
• 2 实验方法
• 2.1 手术方法
• 2.2 供体手术
• 2.3 供肾灌注
• 2.4 受体手术
• 2.5 尿路重建
• 2.6 预置原右肾肾血管体外结扎线
• 2.7 分组
• 2.8 病理学评分
• 3 实验结果
• 4 分析和讨论
• 三、肾脏联合睾丸支持细胞共同移植
• 1 实验材料和实验方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要仪器与设备
• 2 实验方法
• 2.1 大鼠原位肾脏模型的建立
• 2.2 SD 大鼠睾丸支持细胞悬液的植入
• 2.3 SD 大鼠睾丸组织的植入
• 2.4 试验分组
• 2.5 病理组织学观察
• 3 结果
• 3.1 病理组织学观察
• 3.2 生存时间及血肌酐测定结果
• 4 分析和讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和攻读硕士学位期间研究成果
• 致谢