蛋清肽—钙配合物的制备及促进钙吸收作用研究

论文摘要

为获得高生物效价的补钙制剂及提高蛋清蛋白的附加值,本文首先对蛋清蛋白进行酶法改性,采用正交试验,分别对酶解条件及肽-钙配合反应条件进行优化；然后采用超滤技术对蛋清肽分级分离,并通过液质联用技术对高结合钙能力的蛋清肽级分中的肽的一级结构进行了鉴定。利用红外光谱法、圆二色谱法、透射电镜、氨基酸分析等技术手段比较蛋清肽与Ca2+反应前后的结构及构象的变化；同时采用大鼠缺钙模型研究蛋清肽-钙配合物的补钙作用；最后利用蛋壳作为生产蛋清肽-钙螯合物的天然钙源。本文主要研究结果如下：1.促钙吸收蛋清肽的制备制备促钙吸收蛋清肽的最优条件为：先碱性蛋白酶Alcalase、后中性蛋白酶Neutrase双酶酶解,酶解条件为料液比6%、Alcalase酶底比1:100、pH8.0、酶解时间3h; Neutrase酶底比1：25、pH7.0、酶解时间3h。在此条件下,可溶性钙结合量为21.15mg/L,水解度为8.66%。制备蛋清肽时,使用双酶的水解效果优于单酶。2.蛋清肽-钙配合物的制备（1）蛋清肽与钙的络合反应最优反应条件为：肽钙（CaCl2）质量比2.5：1、pH 9.5、底物质量分数4%、水浴温度55℃,搅拌反应20min,制得钙质量分数为8.75%的蛋清肽-钙配合物。（2）经过超滤膜分离后的蛋清肽,其钙结合能力与分子质量大小呈负相关关系。分子质量小于1 kDa的蛋清肽结合钙的能力最强,其制备的肽-钙配合物中的钙质量分数为23.95%,与未分级的原酶解物相比,其钙结合能力提高了三倍。（3）利用蛋壳制备乳酸钙的最优条件为：蛋壳粉用量为5g时,乳酸用量6mL,液固比为15：1,在30℃下反应3.2 h。在此条件下制得的产物的乳酸钙的纯度可达96.94%,产率达99.35%。3.蛋清肽-钙配合物体内促钙吸收作用高剂量EWP-Ca （106.4mg Ca/kg-bw）配合物可以显著提高大鼠股骨干重、骨钙含量、股骨骨密度,增长股骨直径（P<0.01）；高剂量EWP-Ca组（106.4mgCa /kg-bw）的股骨直径极显著（P<0.01）高于相同钙含量的碳酸钙组,而其骨钙含量显著（P<0.05）高于相同钙含量的碳酸钙组,说明EWP-Ca具有明显的强骨壮骨作用,且效果优于相同钙含量的碳酸钙组。4.蛋清肽及蛋清肽钙配合物的结构解析（1）利用红外光谱、圆二色谱比较了蛋清肽与钙反应前后的变化,红外光谱的结果显示蛋清肽结构中的氨基和羧基都参与了与Ca2+的配位,配合物中的Ca2+与羧基间可能是通过双单齿形式结合；圆二色谱的变化显示蛋清肽结合钙后,肽链的构象及链-链相互作用均发生了明显变化。（2）采用透射电镜观察蛋清肽与钙反应后的微观结构,发现当Ca2+浓度足够高时,Ca2+可在两个或多个羧基之间形成盐桥,将肽分子连接成聚集体。（3）氨基酸分析结果显示蛋清肽-钙配合物中酸性氨基酸和酰胺类氨基酸的总含量较高。利用液质联用技术结合在线串联质谱数据库检索比对,解析得到六个小肽的一级结构,分别为：QNQ、QAF、QMM、MVLV、NVLQPS和KLKPI。此六个肽中酰胺类氨基酸（Q和N）含量较高,而酰胺类化合物的侧链含有游离的氨基,可参与配位。其中的三肽、四肽是依靠端基原子参与配位的；而链稍长的五肽、六肽除端基原子可以参与配位外,链中Q或K亦可以参与配位；这六个短肽均为促钙吸收肽。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 绪论
• 1.1 蛋清的研究概况
• 1.1.1 蛋清蛋白质
• 1.1.2 蛋清加工（研究）现状
• 1.2 蛋清肽的生理活性研究
• 1.2.1 抗高血压活性
• 1.2.2 抗疲劳活性
• 1.2.3 免疫调节活性
• 1.2.4 抗凝血酶活性
• 1.3 钙的生理特点与补钙制剂的发展
• 1.3.1 钙与人体健康
• 1.3.2 补钙制剂的发展现状
• 1.3.3 促进钙吸收活性肽的研究
• 1.4 肽-钙螯合物的研究进展
• 1.5 本研究的目的意义及创新性
• 第二章 促钙吸收蛋清肽的制备研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 原料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 蛋清粉的制备
• 2.2.2 蛋清肽的制备
• 2.2.3 水解度的测定
• 2.2.4 可溶性钙结合量测定
• 2.2.5 蛋白酶活力的测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 几种单酶的酶解效果比较
• 2.3.2 几组双酶的酶解效果比较
• 2.3.3 先碱性酶后中性蛋白酶酶解的正交试验
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 蛋清肽-钙配合物的制备研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 原料
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 主要试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 肽-钙配合物的制备
• 3.2.2 肽钙配合反应产物中钙质量分数测定
• 3.2.3 产物的成分分析
• 3.2.4 超滤膜分离蛋清肽
• 3.2.5 蛋壳转化制备乳酸钙
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 制备肽-钙配合物反应条件的单因素实验
• 3.3.2 制备肽-钙配合物的正交试验
• 3.3.3 产物成分结果
• 3.3.4 超滤膜分离结果
• 3.3.5 蛋壳制备乳酸钙的单因素实验
• 3.3.6 蛋壳制备乳酸钙的正交实验
• 3.3.7 原子吸收法测定结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 测定肽结合钙能力的间接法与直接法的比较
• 3.4.2 测定钙含量不同方法的比较
• 3.5 本章小结
• 第四章 蛋清肽-钙配合物体内促钙吸收作用研究
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 实验动物
• 4.1.2 实验材料
• 4.1.3 实验试剂与仪器
• 4.1.4 自制低钙饲料和普通饲料
• 4.2 方法
• 4.2.1 样品制备
• 4.2.2 分组与给药方式
• 4.2.3 血清钙含量的测定
• 4.2.4 血清磷含量的测定
• 4.2.5 血清碱性磷酸酶活性的测定
• 4.2.6 股骨干重、长度、直径及骨钙含量的测定
• 4.2.7 股骨骨密度的测定
• 4.2.8 数据统计与处理
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 蛋清肽-钙配合物对大鼠血清钙、血清磷含量及血清碱性磷酸酶活力的影响
• 4.3.2 蛋清肽-钙配合物对大鼠股骨长度、股骨直径的影响
• 4.3.3 蛋清肽-钙配合物对大鼠股骨重量、骨钙含量的影响
• 4.3.4 蛋清肽-钙配合物对大鼠股骨骨密度的影响
• 4.4 讨论
• 4.4.1 动物实验指标的考察
• 4.4.2 蛋清肽-钙配合物促进钙吸收作用探讨
• 4.5 本章小结
• 第五章 蛋清肽及蛋清肽-钙配合物的结构
• 5.1 材料与试剂
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验试剂
• 5.1.3 仪器设备
• 5.2 方法
• 5.2.1 红外光谱法
• 5.2.2 氨基酸分析
• 5.2.3 透射电镜法
• 5.2.4 圆二色谱法
• 5.2.5 蛋清肽的HPLC分析
• 5.2.6 蛋清肽的LC-ESI/MS分析
• 5.2.7 质谱解析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 红外结构分析
• 5.3.2 氨基酸分析
• 5.3.3 透射电镜结果分析
• 5.3.4 圆二色谱结果分析
• 5.3.5 蛋清肽（Mm<1 kDa）的HPLC分析
• 5.3.6 蛋清肽（Mm<1 kDa）的HPLC-ESI/MS/MS分析
• 5.4 讨论
• 5.4.1 促进钙吸收蛋清肽的氨基酸序列分析
• 5.4.2 促进钙吸收蛋清肽的构效关系探讨
• 5.5 本章小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录 （攻读硕士学位期间发表的论文）