持久性有机污染物比较毒性的体外研究

论文摘要

持久性有机污染物（Persistent Organic Pollutants, POPs）因为具有长期残留、生物蓄积、半挥发和高毒等特性,并能够在大气、水和土壤等环境中长距离迁移,最终通过食物链进入人体,引起了国际社会的广泛关注。研究发现长期慢性暴露POPs可能会导致癌症,损害中枢和外周神经系统,破坏免疫系统,破坏生殖力及影响婴幼儿正常发育；某些持久性有机污染物对人类的影响会持续几代,对人类生存繁衍和可持续发展构成重大威胁。2,2’,4,4’,5,5’-六氯联苯（2,2’,4,4’,5,5’-hexa-chlorobip-he nyl,PCB153）、全氟辛烷磺酸（Perfluorooctane sulfonates,PFOS）和苯并芘（Benzopyre ne, B（a）P）都是工业生产中存在的持久性有机污染物,已经有一些报道显示以上化学物的暴露会影响正常的雄性生殖过程。但是以往的研究多集中在成年期暴露及宫内暴露,对新生期暴露研究甚少；另外由于体内实验受多种因素的干扰作用,难以判定化学物的直接毒性作用及作用机制,因此本研究旨在建立新生期精原-支持细胞共培养系（Sertoli/germ co-culture, SGC）,分别暴露PCB153、PFOS和B（a）P三种持久性有机污染物,观察直接毒性效应并对三种持久性化学物进行分类评价。结果一：大鼠新生期精原-支持细胞共培养系（Sertoli/germ co-culture, SGC）建立经过两步酶消化法分离得到睾丸细胞,分别用油红O和碱性磷酸酶鉴定支持细胞和精原细胞,证明培养系主要是这两型睾丸细胞组成。形态学观察及台盼兰活性计数发现SGC共培养系细胞在72小时内生长状态良好,可以在时期进行化学物的毒性测定。至此大鼠新生期SGC细胞系建立成功。结果二、PCB153、PFOS和B（a）P对SGC共培养系细胞的直接毒性作用形态学分析显示PCB153、PFOS和B（a）P暴露24小时后均引起SGC共培养系细胞的形态变化,发现支持细胞变瘦长,细胞间隙扩大,精原细胞从支持细胞表面脱落聚集,出现大量细胞碎片；提示三种POPs对睾丸细胞具有直接毒性效应。细胞活力水平测定发现PCB153、PFOS和B（a）P暴露均导致细胞活力水平下降,且呈剂量反应关系,其中B（a）P和PCB153在10μmol/L即使细胞活性下降,PFOS在50μmol/L才有这种效应。流式细胞仪定量分析发现PCB153在50μmol/L染毒组的早期凋亡率明显高于对照组,差异有统计学意义,但是晚期凋亡率各个剂量组没有明显差异。PFOS和B（a）P早期凋亡率也都升高,但与对照组比较差异无统计学意义。支持细胞波形蛋白免疫荧光染色结果显示,PCB153、PFOS和B（a）P暴露24h后都使支持细胞波形蛋白染色变淡,波形蛋白形态异常。FITC-鬼笔环肽标记的细胞骨架（F-actin）也出现排列紊乱、断裂等不规则的现象。三种POPs在不同剂量水平引起波形蛋白损伤,如B（a）P和PFOS分别在10μmol/L和50μmol/L引起波形蛋白表达水平的下降,而PCB153达到100μmol/L时才观察到这种现象。SGC共培养细胞活性氧表达水平荧光检测结果显示,PCB153、PFOS和B（a）P暴露24h后都不同程度诱导了细胞活性氧水平上升,且呈剂量反应关系。PCB1531μmol/L时活性氧水平升高,与对照组相比差异有统计学意义；B（a）P和PFOS在在50μmol/L才引起活性氧水平的显著上升。根据以上四种指标的毒性效应数据,聚类分析结果显示,三种POPs化学物的五个剂量水平可以大体分为三类,但是三种POPs的敏感指标可能不同。如PCB153在低剂量即引起细胞的氧化应激反应,B（a）P的敏感指标是波形蛋白,而PFOS可能对支持细胞骨架的影响比较大。主成分分析结果显示,在第一主成分表达式中,主要反映了活性氧,波形蛋白,细胞活力抑制方面的综合指标；第二主成分从细胞凋亡角度反映了化学物的毒性效应。并且发现活性氧、波形蛋白和细胞活力抑制三者的相关性较高。结果三：利用新生期SGC共培养系探讨PCB153和甲状腺素的相互作用PCB具有内分泌干扰作用,新生期暴露PCB导致甲状腺激素水平下降,同时精子水平也受到影响；为了探讨PCB是直接作用于睾丸细胞干扰生精过程还是通过干扰甲状腺激素水平间接影响生精过程,我们在体外单独暴露PCB及与甲状腺激素联合暴露,比较两者对细胞增殖分化基因的影响。实验结果发现PCB和甲状腺激素均可干扰睾丸细胞增殖分化基因NCAM、P27和AMH的表达水平,但T3只拮抗了PCB对P27基因的下调作用,对PCB引起的其他基因表达水平的改变调控作用不明显,提示PCB一方面可以直接作用于睾丸细胞,一方面可能通过干扰甲状腺素这两种途径来调控睾丸细胞的增殖分化。以上结果提示：PCB153、PFOS和B（a）P对SGC共培养系细胞有直接毒性作用,进而干扰睾丸的正常生精过程,影响生殖系统的建立。新生期大鼠睾丸SGC共培养系可以作为评价雄性生殖毒物毒性的平台。

论文目录

• 主要中英文缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一节 精原-支持细胞（SGC）共培养系的建立
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二节 化学物的新生期精原-支持细胞共培养毒性评价模型
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三节 利用新生期精原-支持细胞共培养系探讨PCB和甲状腺素的相用作用
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 硕士期间工作小结
• 致谢
• 综述 全氟辛烷磺酰基化合物雄性生殖毒性研究进展
• 参考文献