条斑紫菜质外体锰超氧化物歧化酶的基因表达分析

论文摘要

条斑紫菜是世界栽培海藻中最具经济价值的红藻之一,同时也是潮间带海藻的模式物种,是开展藻类遗传学、抗逆分子生理学和基因组学研究的理想材料。本论文以条斑紫菜为研究材料,从抗氧化酶——超氧化物歧化酶的基因表达及其酶活变化,探讨紫菜抗逆的分子基础,以期深入了解条斑紫菜适应环境胁迫的分子机制。通过分析预测的条斑紫菜锰超氧化物歧化酶（PyMn SOD; EC 1.15.1.1）氨基酸序列,找到了Mn SOD所具备的特征氨基酸;利用Native-PAGE和SOD对不同抑制剂敏感的特性,确定了条斑紫菜中仅含有Mn SOD。将本实验室克隆的PyMn SOD全长cDNA与原核表达载体pET-30（+）连接,构建重组表达质粒pET-S;转化大肠杆菌BL21（DE3）表达PyMn SOD,表达产物的分子量大小约为30 KDa,部分可溶性蛋白具有特异性SOD活性,部分以不可溶的包涵体形式存在。研究确定了重组蛋白的最佳诱导表达条件:培养温度25℃,诱导时间4h。利用不同浓度的Mn2+诱导重组PyMn SOD的表达,可以检测到比活力随Mn2+浓度增高而上升的趋势。表明Mn2+对于提高Mn SOD的活性具有一定的促进作用。条斑紫菜两种世代的SOD比活力测定发现,配子体（叶状体）的SOD比活力比孢子体（丝状体）的高,是其2.68倍,表现出了两种世代对于环境的适应性。Native-PAGE活性染色研究发现,条斑紫菜仅含有一种类型的SOD,即Mn SOD,与一些原核的蓝藻和厌氧菌类似,说明条斑紫菜抗氧化系统仍处于原始的方式。用重组PyMn SOD免疫两只新西兰大白兔,制备了多克隆抗体,间接酶联免疫吸附实验（ELISA）检测到多克隆抗体的效价为1:8000,免疫印迹实验（Western Blotting）表明该多克隆抗体具有很好的特异性。为了研究PyMn SOD的细胞定位,利用免疫胶体金标记技术发现PyMn SOD定位于质外体中,并且在两个世代中没有差异,表现出与高等植物质外体SOD定位的相似性。为了研究PyMn SOD在条斑紫菜配子体（叶状体）处于失水胁迫中的作用,我们对其进行失水与复水处理,测定了PyMn SOD的活性并且分析了表达量,结果表明条斑紫菜配子体（叶状体）处于失水胁迫时,主要通过提高增强比活力的途径来起到清除O2·-的作用,其中比活力提高了2.67倍,说明了PyMn SOD在保护质膜免受O2·-损害的重要作用;并且确定了丙二醛作为衡量条斑紫菜配子体（叶状体）失水胁迫程度的指标。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 综述
• 1.1 植物超氧化物歧化酶研究综述
• 1.1.1 前言
• 1.1.2 植物中氧自由基（ROS）的形成
• 1.1.3 引起植物体产生 ROS 的环境因素
• 1.1.4 植物中氧自由基（ROS）的清除
• 1.1.5 植物中 Mn SOD 的理化性质与功能
• 1.1.6 藻类 SOD 的研究进展
• 1.1.7 SOD 的应用
• 1.2 条斑紫菜的生物学特性
• 1.2.1 前言
• 1.2.2 条斑紫菜的形态结构特征
• 1.2.3 条斑紫菜的生活史
• 1.2.4 条斑紫菜的功能基因组学研究进展
• 1.2.5 条斑紫菜的功能基因研究进展
• 1.3 本研究的内容和意义
• 1.3.1 本研究立项依据和意义
• 1.3.2 本研究主要内容
• 2 条斑紫菜Mn SOD 的类型鉴定、原核表达及活性检测
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂与仪器
• 2.1.3 PySOD 粗酶液的制备
• 2.1.4 PySOD 类型鉴定
• 2.1.5 表达载体构建策略
• 2.1.6 重组蛋白的表达与诱导条件的优
• 2.1.7 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.1.8 Bradford 法测定蛋白含量
• 2.1.9 SOD 比活力测定
• 2.2 结果
• 2.2.1 PyMn SOD 的氨基酸序列分析
• 2.2.2 PySOD 类型的确定
• 2.2.3 PyMn SOD 重组子pET-S 的PCR 鉴定与测序
• 2.2.4 重组融合蛋白 PyMn SOD 的诱导表达与条件优化
• 2.2.5 重组融合蛋白 PyMn SOD 的活力测定
• 2.3 讨论
• 2.3.1 条斑紫菜中仅含有Mn 型SOD
• 2.3.2 原核表达载体pET-30c（+）适用于 PyMn SOD 的高效表达
• 2+能够诱导提高重组 PyMn SOD 的活性'>2.3.3 Mn²⁺能够诱导提高重组 PyMn SOD 的活性
• 3 条斑紫菜SOD 多克隆抗体制备、免疫印迹与细胞定位
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试剂与仪器
• 3.1.3 多克隆抗体的制备
• 3.1.4 间接ELISA 测定多克隆抗体效价
• 3.1.5 Western Blot
• 3.1.6 条斑紫菜细胞超薄切片的制备
• 3.1.7 免疫胶体金标记
• 3.1.8 条斑紫菜两种世代 Mn SOD 比活力的比较
• 3.2 结果
• 3.2.1 重组融合蛋白PyMn SOD 的多克隆抗体的效价
• 3.2.2 重组融合蛋白 PyMn SOD 的免疫印迹分析（Western Blot）
• 3.2.3 孢子体 PyMn SOD 和配子体 PyMn SOD 的活性比较
• 3.2.4 孢子体 PyMn SOD 的细胞定位
• 3.2.5 配子体 PyMn SOD 的细胞定位
• 3.3 讨论
• 3.3.1 凝胶回收蛋白的方法制备多克隆抗体获得良好的特异性结果
• 3.3.2 配子体PyMn SOD 和孢子体PyMn SOD 分别表现出对环境的适应
• 3.3.3 PyMn SOD 定位于质外体中
• 4 失水胁迫对条斑紫菜配子体 Mn SOD 活性的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试剂与仪器
• 4.1.3 样品处理
• 4.1.4 丙二醛（MDA）含量的测定
• 4.1.5 蛋白含量测定
• 4.1.6 SOD 比活力测定
• 4.1.7 Western Blot
• 4.2 结果
• 4.2.1 水分胁迫与丙二醛（MDA）之间的关系
• 4.2.2 失水胁迫对 PyMn SOD 表达量和活性的影响
• 4.3 讨论
• 4.3.1 丙二醛（MDA）可以用作衡量条斑紫菜配子体（叶状体）失水胁迫程度的指标
• 4.3.2 PyMn SOD 在条斑紫菜配子体（叶状体）失水胁迫中的作用
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 学术论文情况