论文摘要
甲型流感病毒（influenza A virus）是一种引起最为常见和高传染性人类疾病的因素,该病毒分布于世界各地,在人类和动物中具高致病率和死亡率。尽管对流感病毒进行了广泛的临床和病理学研究,但我们对于流感的发病机制仍不完全明了。哺乳动物先天性免疫系统通过一类属于Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）家族的受体识别入侵病原体。病毒感染可触发一系列免疫反应能有效限制病毒复制和病毒感染的传播。目前研究发现病毒感染的巨噬细胞TLR7表达上调,表达TLR7的细胞主要为免疫细胞,包括浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid DC,pDC）和巨噬细胞。pDC和巨噬细胞可通过TLR7介导识别病毒ssRNA,通过髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88）途径发挥先天抗病毒免疫反应,导致共刺激分子的活化和细胞因子的产生,并引发随后的特异性免疫应答;如果该通路活化失控,则会导致大量前炎症介质产生,导致机体的炎症损伤。中医学认为流感的病机主要是“毒损肺络”,为感染性肺损伤,是流感病毒的致炎与机体的抗炎反应过程。在本实验研究中,我们观察毒热平注射液体外抗流感病毒的方式及效率,探讨TLR7识别单链RNA病毒----流感病毒的分子机制,结合中医理论揭示毒热平注射液抗病毒的分子靶点。目的:研究流感病毒感染细胞后的致病机制,以及毒热平注射液体外不同加药方式及不同作用时间对流感病毒在感染细胞中增殖的作用机制。通过测定流感病毒感染的小鼠腹腔巨噬细胞释放NO和相关细胞因子水平的动态变化,包括:活化正常T细胞表达和分泌的调节物（regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted,RANTES）、巨噬细胞炎性蛋白（macrophage inflammatory protein,MIP-1α）、白细胞介素-6（interleukin 6, IL-6）、干扰素-β（interferonβ, IFN-β）和干扰素诱导蛋白（induced protein 10, IP-10）,以及TLR7介导的依赖MyD88的信号传导通路。阐述毒热平注射液是否下调流感病毒感染的巨噬细胞以TLR7介导的依赖MyD88（髓样分化因子88）的信号传导通路的活化,抑制炎性细胞因子的过量产生,减轻炎症反应的作用机制,为临床应用提供实验依据。方法:1毒热平注射液体外抗流感病毒增殖:以狗肾细胞（MDCK）为切入点,采用结晶紫染色法观察毒热平注射液不同加药方式对流感病毒亚甲型鼠肺适应株（FM1）的体外抑制作用及其时效关系（24h、36h、48h和72h）;探讨毒热平注射液体外抗流感病毒的效果及特点。2观察毒热平注射液对流感病毒感染巨噬细胞释放NO水平的动态变化:用流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1感染小鼠腹腔巨噬细胞株Ana-1,然后加入不同浓度的毒热平注射液作用不同的时间（6h、12h、24h和36h）,分别收集巨噬细胞上清。采用传统的Griess试剂法检测NO水平。3毒热平注射液对流感病毒感染巨噬细胞分泌细胞因子的影响:采用ELISA方法测定不同剂量毒热平注射液作用于流感病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞不同时间（6h、12h、24h）后,其分泌活化正常T细胞表达和分泌的调节物（regulated upon activation,normal T cell expressed and secreted,RANTES）、巨噬细胞炎性蛋白（macrophage inflammatory protein,MIP-1α）、干扰素诱导蛋白-10（induced protein 10,IP-10）、白细胞介素-6（interleukin 6,IL-6）和干扰素-β（interferonβ,IFN-β）的的动态变化。4毒热平注射液对TLR7介导的抗病毒信号转导通路各信号蛋白的影响:采用实时荧光定量PCR（real-time Q PCR）研究毒热平注射液不同剂量（10μg/ml组和1μg/ml组）和不同作用时间（12h和24h）对流感病毒感染的小鼠腹腔巨噬细胞,利用TLR7依赖的信号转导通路发挥抗病毒作用的具体分子机制。观察Toll样受体7（Toll-like receptor7, TLR7）、髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88）、白细胞介素-1受体相关激酶（IL-1 receptor associated kinase 4, IRAK4）、肿瘤坏死因子相关激酶6（TNF receptor associated kinase 6, TRAF6）和核因子-κB P65（nuclear factor-κB P65, NF-κB p65）mRNA表达水平;用Western-bolt的方法检测毒热平注射液对信号转导通路中核因子NF-κB p65蛋白表达的影响。结果:1毒热平注射液能明显阻止流感病毒吸附于细胞,并抑制细胞内病毒的复制增殖,在高浓度（≥0.18 mg/ml）时有直接杀病毒作用。抗病毒效率在48小时达高峰,且随时间延长在高浓度（≥0.27 mg/ml）时基本不变,而在低浓度时有下降趋势。2用六个不同浓度的毒热平注射液作用于流感病毒感染后的巨噬细胞不同的时间,各剂量组均能程度不等的下调活化巨噬细胞释放NO的水平,体现了剂量依赖性但无时间依赖性。毒热平注射液的60μg/ml、30μg/ml和10μg/ml浓度下调NO水平作用尤为明显。3 ELISA检测发现,病毒感染巨噬细胞6h后其分泌IL-6、MIP-1α、IP-10和RANTES的水平在逐渐升高,到感染后的12h达高峰,感染24h后又有所下降,呈现动态的变化。在每个时段毒热平注射液能显著下调病毒感染的巨噬细胞分泌IL-6、MIP-1α、IP-10和RANTES的水平而上调IFN-β的水平。这种作用有剂量依赖性但无时间依赖性。4实时定量荧光PCR（real-time Q PCR）结果表明,毒热平注射液能适度下调包括TLR7在内的MyD88、IRAK4、TRAF6和NF-κB p65 mRNA的表达,显著低于病毒对照组且毒热平注射液下调病毒感染巨噬细胞的TLR7介导的抗病毒信号转导通路的作用具有时间和剂量依赖性。5 Western-blot实验的结果显示,毒热平注射液的两个剂量组:10μg/ml组和1μg/ml组均能明显下调流感病毒感染的巨噬细胞NF-κB p65蛋白的表达,且该下调作用具剂量和时间依赖性。结论:1毒热平注射液抗流感病毒作用是通过多种方式来实现的:对流感病毒感染有一定的预防作用;能抑制病毒吸附于宿主细胞;抑制进入细胞内病毒的复制增殖;且抗病毒作用稳定、明显。2毒热平注射液可剂量依赖性的抑制巨噬细胞炎症因子和趋化因子的产生,该作用是通过抑制NF-κB信号转导通路实现的。该药显著下调NO、IL-6、RANTES、MIP-1α和IP-10水平,减轻炎性病理损伤;促进IFN-β的分泌水平,调节机体免疫功能,从而提高机体抗病毒作用,增强抗病毒能力而减轻病毒对机体的损伤作用,控制病情发展。3毒热平注射液可通过调节TLR7介导的MyD88依赖的信号通路（MyD88-dependent pathway）发挥抗病毒作用,且该作用具有时间和剂量依赖性。该药能显著下调病毒感染巨噬细胞内TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6和NF-κB p65 mRNA表达水平,以及核因子NF-κB p65蛋白的表达。为研究中药抗病毒作用开拓了一条新的探索途径。4毒热平注射液可直接和间接发挥有效的抗病毒作用。通过抑制病毒增殖,间接诱生干扰素和调节人体免疫功能而达到抗病毒作用,既体现了清热解毒、凉血通络的功效,实现了“驱邪”和“扶正”的统一;又体现了该药根据“毒损肺络”的病机理论,针对炎症反应配伍研制的创新所在。