神经元型一氧化氮合酶介导氟西汀抗抑郁作用的研究

论文摘要

抑郁症（depression）是由生物遗传因素和心理社会因素引起的情感性精神障碍（affective disorders）,以心境显著而持久的低落为基本临床表现并伴有相应思维和行为异常的一类精神障碍。抑郁症发病机制极其复杂,虽然建立与发展了许多学说,从“传统单胺假说”、“现代单胺假说”过渡到目前占主导地位的“信号通路假说”,各种假说对抑郁症发病机制的解释错综复杂,这些假说均是基于对抗抑郁药作用机制的研究。通过药物作用机制研究,认识抑郁症的发病机制,建立各种假说,并有针对性地发展新的抗抑郁药,因此研究抗抑郁药的作用机制有着重要意义。本文关注的对象就是神经元型一氧化氮合酶（nNOS）在氟西汀抗抑郁作用中的角色。课题应用多种实验技术和方法,旨在阐明两个问题:（1）抗抑郁药是否调节nNOS的表达;（2）nNOS是否介导抗抑郁药的行为学作用。最终目的是从整体、细胞、分子水平,探讨nNOS与抗抑郁药氟西汀的关系,为临床抑郁症的防治和新的抗抑郁药研发提供新的思路。本课题的主要结果和讨论简述如下:1.氟西汀调控海马nNOS的表达未预知的长期温和应激（CMS）连续刺激小鼠21天,成功制备抑郁症动物模型。抑郁状态下小鼠海马nNOS蛋白表达显著升高。这暗示nNOS高表达参与抑郁症的发病。为了说明nNOs可能参与抑郁症的治疗,生理状态下予小鼠腹腔注射氟西汀（10mg/kg）连续11天或21天,发现小鼠海马nNOS的mRNA表达和蛋白表达显著下调。为了进一步研究氟西汀对nNOS表达调控的时效关系,我们检测了氟西汀分别给药1天、3天、7天的海马nNOS表达的改变。结果显示氟西汀给药3天、7天后海马nNOS表达显著下降,急性（1天）给药后,海马nNOS表达与对照组相比没有显著差异。同样,我们还检测了氟西汀给药对NOS活性的影响。结果表明小鼠腹腔注射氟西汀（10mg/kg）连续21天后其海马NOS活性显著下调。这些结果提示nNOS可能参与5-羟色胺再摄取抑制剂氟西汀的抗抑郁作用机制。2.三环类抗抑郁药对海马nNOS表达的调控增加突触间隙去甲肾上腺素浓度的三环类抗抑郁药丙咪嗪（20mg/kg,腹腔注射,21天）和去甲丙咪嗪（20mg/kg,腹腔注射,21天）对小鼠海马nNOS的表达没有影响。而耗竭脑内去甲肾上腺素的利血平（0.3mg/kg,腹腔注射,21天）对小鼠海马nNOS表达也没有影响。这暗示nNOS的表达可能与突触间隙去甲肾上腺素递质水平无关。氟西汀显著下调nNOS的表达,这为证明nNOS分子介导抗抑郁药的作用机制提供了理论可能性。为了阐明nNOS在氟西汀抗抑郁作用中的关键作用,我们使用了两个工具:L-精氨酸和nNOS-/-小鼠。L-精氨酸是生理状态下唯一由NOS催化的生理性一氧化氮供体。利用L-精氨酸的目的,是升高nNOS来源的NO,间接阻断由氟西汀诱导的nNOS-NO下降。3.L-精氨酸削弱氟西汀在强迫游泳、悬尾实验模型上的抗抑郁作用为了阐明nNOS下调是否参与氟西汀的抗抑郁作用,我们观测了L-精氨酸对氟西汀抗抑郁作用的影响。强迫游泳（FST）和悬尾实验（TST）是检测抗抑郁作用的最常用急性指标。腹腔注射氟西汀（10mg/kg）后30-60分钟,小鼠在FST和TST实验中的不动时间显著缩短,即产生显著的抗抑郁作用。氟西汀给药前30分钟接受L-精氨酸（750mg/kg）预处理,则小鼠的不动时间较氟西汀所诱导的不动时间显著延长,即L-精氨酸有效削弱氟西汀在FST、TST模型上的抗抑郁作用。为了说明L-精氨酸的作用是通过作为底物促进nNOS合成NO而实现的,我们设计了另一组实验利用同分异构体D-精氨酸来排除L-精氨酸的作用是通过非NO途径的其他非特异性作用实现的。研究结果表明D-精氨酸对氟西汀所引起的小鼠不动时间缩短没有影响。这说明L-精氨酸阻断氟西汀在FST、TST模型上的抗抑郁作用可能是通过L-精氨酸-NOS-NO途径实现的。4.L-精氨酸完全阻断氟西汀在新奇-摄食抑制实验模型上的抗抑郁作用急性的抗抑郁作用不能解释抗抑郁药临床药效延迟效应,因此我们利用了能解释临床药效延迟效应的新奇-摄食抑制实验（NSF）作为另一检测抗抑郁作用的慢性指标。腹腔注射氟西汀（10mg/kg）连续28天后,小鼠在新奇环境中的摄食潜伏期显著缩短,即产生显著的抗抑郁作用。但每日氟西汀给药前30分钟接受L-精氨酸（750mg/kg,腹腔注射）预处理,小鼠的摄食潜伏期则显著延长,甚至超过赋形剂对照组,即L-精氨酸完全阻断氟西汀在NSF模型上的抗抑郁作用。同样我们设计了另一组实验利用同分异构体D-精氨酸来排除L-精氨酸的作用是通过非NO途径的其他非特异性作用实现的。研究结果表明D-精氨酸对氟西汀所引起的小鼠摄食时间缩短没有影响。这说明L-精氨酸完全阻断氟西汀在NSF模型上的抗抑郁作用是通过L-精氨酸-NOS-NO途径实现的。我们同时检测了小鼠在熟悉环境（饲养环境）中摄食潜伏期和15分钟内的摄食量,排除了氟西汀组小鼠在新奇环境中的摄食潜伏期的改变是由于食欲亢进所致。5.L-精氨酸削弱氟西汀的促海马神经元增殖作用海马齿状回神经元再生增加是抗抑郁药发挥抗抑郁作用的标志之一。既然L-精氨酸可有效阻断氟西汀在FST、TST、NSF这三种动物模型上的作用,那么L-精氨酸能否阻断氟西汀的促神经元增殖作用呢?氟西汀（10mg/kg,腹腔注射）连续给药28d结束后,予小鼠腹腔注射DNA合成标记BrdU（50mg/kg,给药2次,间隔12小时）,末次给药后12小时,4%多聚甲醛灌注固定脑组织,免疫组化鉴定海马齿状回颗粒细胞下层BrdU阳性细胞数。结果表明,氟西汀给药28d可显著增加海马齿状回颗粒细胞下层Brdu阳性细胞数。氟西汀每日给药前接受L-精氨酸（750mg/kg,腹腔注射）预处理,则小鼠海马BrdU阳性细胞数显著减少,接近赋形剂对照组水平。以上结果表明L-精氨酸有效削弱氟西汀的促神经元增殖作用,提示氟西汀的促神经元增殖作用可能是通过L-精氨酸-NOS-NO途径实现的。氟西汀下调nNOS的表达,而L-精氨酸有效的削弱了氟西汀的抗抑郁作用,这说明nNOS的下调介导了氟西汀的抗抑郁作用。为了进一步证明这一推论,我们利用了另一个工具一nNOS基因敲除小鼠。由于nNOS-/-小鼠完全不表达nNOS,即从另一个角度阻断了氟西汀对nNOS的下调。6.nNOS-/-小鼠特性:对抑郁抵抗nNOS-/-小鼠海马NO的含量显著低于野生型小鼠。在FST中,在接受同样的强迫游泳应激后,与野生型小鼠相比,nNOS-/-小鼠5分钟内水中不动时间显著缩短。在NSF中,在新奇环境中,nNOS-/-小鼠摄食的潜伏期显著短于野生型小鼠。综合上述两个行为学实验的结果,我们认为nNOS-/-小鼠具有对抑郁抵抗的特性,这充分说明了nNOS蛋白与抑郁症关系密切。7.在强迫游泳模型上,nNPS-/-小鼠对抗抑郁药氟西汀没有反应上述实验结果说明选择性的敲除编码nNOS蛋白的基因产生抗抑郁行为。为了进一步证实nNOS作为氟西汀的下游在抗抑郁作用中发挥关键作用,我们接下来检测野生型小鼠和nNOS-/-小鼠对氟西汀的反应。实验结果显示接受氟西汀（10mg/kg）腹腔注射的野生型小鼠在强迫游泳过程中的不动时间显著缩短,然而接受氟西汀（10mg/kg）腹腔注射的nNOS-/-小鼠在强迫游泳过程中不动时间没有改变,即nNOS-/-小鼠对氟西汀治疗没有反应。8.在新奇-摄食抑制实验模型上,nNOS-/-小鼠对抗抑郁药氟西汀没有反应。我们在NSF模型上再次验证nNOS-/-小鼠对氟西汀治疗的反应。氟西汀（10mg/kg,腹腔注射）连续给药28天,野生型小鼠在新奇环境中的摄食潜伏期显著缩短,然而接受氟西汀治疗的nNOS-/-小鼠在新奇环境中的摄食潜伏期没有改变,即同样的抗抑郁药治疗对nNOS-/-小鼠却没有影响。NSF模型上,nNOS-/-小鼠对氟西汀的反应与FST结果完全一致,再一次证实nNOS-/-小鼠对氟西汀的抗抑郁治疗极为不敏感。9.在nNOS-/-小鼠,氟西汀促神经元增殖作用消失。氟西汀（10mg/kg,腹腔注射）连续给药28天结束后,予小鼠腹腔注射BrdU（50mg/kg,给药2次,间隔12小时）,末次给药后12小时,4%多聚甲醛灌注固定脑组织,免疫组化鉴定海马齿状回颗粒细胞下层BrdU阳性细胞数。长期的氟西汀治疗显著增加了野生型小鼠海马BrdU阳性细胞数。然而nNOS-/-小鼠虽然接受同样的长期氟西汀治疗,但其海马BrdU阳性细胞数没有改变。这充分说明了在nNOS-/-小鼠,氟西汀促神经元增殖作用消失。nNOS-/-小鼠对氟西汀的抗抑郁作用及促神经元再生作用没有反应暗示nNOS介导了氟西汀的抗抑郁作用。值得注意的是,不是由于小鼠品系的原因导致了氟西汀失效,因为作为同一品系的野生型小鼠对氟西汀的抗抑郁作用反应正常。本研究表明,抑郁症的发病和氟西汀的抗抑郁作用与神经元型一氧化氮合酶有密切的关系,这提示对抑郁症的治疗不应仅仅局限于对神经递质的调节,而应对其进行多层次、多途径、多靶点的治疗,其中神经元型一氧化氮合酶应当是抑郁症的一个重要的治疗靶点。

论文目录

• 目录
• 英文缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 氟西汀下调神经元型一氧化氮合酶的表达
• 材料与方法
• 一、动物
• 二、主要试剂和药品
• 三、主要仪器
• 四、动物分组及给药方案
• 五、Bradford法蛋白定量
• 六、海马组织匀浆NOS活性测定
• 七、逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 八、蛋白免疫印迹分析（Western blot）
• 九、动物模型的建立
• 十、数据统计和分析
• 结果
• 一、通过未预知的长期温和应激刺激建立抑郁动物模型,海马nNOS表达异常升高
• 二、长期氟西汀给药下调海马nNOS的表达
• 三、急性氟西汀给药对海马nNOS表达没有影响
• 四、长期氟西汀给药下调海马NOS活性
• 五、长期三环类抗抑郁药给药对海马nNOS表达没有影响
• 六、通过利血平建立神经生化抑郁动物模型,海马nNOS表达没有改变
• 讨论
• 第二部分 L-精氨酸阻断氟西汀的抗抑郁作用
• 材料与方法
• 一、动物
• 二、主要试剂和药品
• 三、主要仪器
• 四、动物分组及给药方案
• 五、动物行为学检测
• 六、Brdu免疫组化
• 七、数据统计和分析
• 结果
• 一、L-精氨酸削弱氟西汀在FST、TST上的抗抑郁作用
• 二、D-精氨酸对氟西汀在FST、TST上抗抑郁作用无影响
• 三、L-精氨酸完全阻断氟西汀在NSF模型上的抗抑郁作用
• 四、D-精氨酸对氟西汀在NSF模型上抗抑郁作用没有影响
• 五、L-精氨酸削弱氟西汀促神经元增殖作用
• 讨论
• 第三部分 nNOS敲除小鼠对氟西汀缺乏反应
• 材料与方法
• 一、动物
• 二、主要试剂与药品
• 三、主要仪器
• 四、动物分组及给药方案
• 五、动物行为学检测
• 六、Brdu免疫组化
• 七、数据统计和分析
• 结果
• -/-小鼠特性:对抑郁抵抗'>一、nNOS^-/-小鼠特性:对抑郁抵抗
• -/-小鼠对氟西汀缺乏反应'>二、在FST模型上,nNOS^-/-小鼠对氟西汀缺乏反应
• -/-小鼠对氟西汀缺乏反应'>三、在NSF模型上,nNOS^-/-小鼠对氟西汀缺乏反应
• -/-小鼠,氟西汀促神经元增殖作用消失'>四、在nNOS^-/-小鼠,氟西汀促神经元增殖作用消失
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录1 在读期间发表的与本论文相关的文章
• 附录2 综述
• 附录3 致谢