论文摘要
cDNA-RDA代表性差异分析技术筛选内异症在位内膜相关基因目的子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是育龄妇女常见的雌激素依赖性疾病,发病率有明显的上升趋势,成为一种“现代病”“多发病”,近十多年来人们从遗传与基因角度做了大量研究,认为EMs是一种多基因,多因素所致疾病,与遗传和发病个体基因的异常改变关系密切。但引起这种异常的原因尚不清楚,有人认为,两者之间存在表型差异;也有人认为,子宫内膜组织是由各种不同反应性的异源性细胞亚群组成,在反流入腹腔的月经期内膜中,那些具有很强生存能力的细胞亚群既可能发展成为内异症,另一方面,异位内膜细胞的这些改变也可能是由于EMs患者腹腔环境的改变而使内膜细胞的生长调节被打乱的结果。近年来,国内外大量学者都将EMs患者的在位内膜作为研究对象,发现其在基因和蛋白表达中都与正常内膜存在差异。如果用有效的方法分离,克隆EMs相关基因,并进行研究,将为EMs的基因诊断和治疗奠定基础。本次实验,我们采用eDNA代表性差异分析方法发现并克隆EMs相关基因,为基因诊断和治疗提供靶基因。材料和方法收集中国医科大学盛京医院2004年10月至2006年12月因EMs手术切除的9例在位子宫内膜组织做为实验组(T组),因原位癌行子宫切除的11例正常子宫内膜做为驱动组(D组),且术前3个月内未接受激素治疗。所有病例年龄范围在35-45之间,两组间无统计学差异,具有可比性。1、总RNA提取及mRNA分离纯化采用Trizol Reagent(GIBCO BRL)分离RNA,用Promega公司Attract mRNAIsolation System产品分离poly(A+)RNA,直接用于合成cDNA。2、cDNA双链合成用TAKARA公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit合成第一链和第二链。3、cDNA-RDA用限制性内切酶Sau3A1分别消化T组和D组的cDNA,在T4连接酶的作用下连上含有该酶酶切位点的R24/12接头,然后进行PCR扩增,纯化并消去接头并将T组更换接头J24/12,T组与D组按1:100比例混合液相杂交,PCR产物即是DpⅠ。同上述方法分别进行第2,3轮杂交,比例分别为1:400和1:80000,T组接头分别为N24/12和J24/12,分别得到DpⅡ和DpⅢ。4、转化和测序将DpⅢ得到的11个片段分别与pMD-18T载体连接,转化并克隆阳性质粒DNA,PCR鉴定后送往上海联合基因公司测序,将结果进行互联网同源性比较和分析。5、RT-PCR验证另取10个正常内膜组织和7个EMs在位内膜组织进行配对,RT-PCR验证,从而证明本实验所获得的差异片段来自mRNA水平。结果1、三轮消减杂交差异性产物比较显示200bp—500bp扩增效率最高,随着消减杂交轮数的增加,所获得的差异片段数目减少,而特异性扩增信号不断增强,第三轮杂交,聚丙烯酰胺凝胶电泳银染后可见条带较清晰分布于200-400bp之间。2、差异cDNA克隆的测序及匹配分析将聚丙烯酰胺凝胶中的条带切割出,二扩后,转染大肠杆菌并克隆,将阳性质粒送往上海联合基因公司测序,共获得11个不同的DNA序列,其中有4个与已知基因部分同源,同源性可达99%,其余未找到同源序列。我们把其中同源性达99%的已知基因之一Cofilin,确定为验证的侯选基因。3、RT-PCR验证结果证实侯选基因来自于mRNA水平,且在EMs中表达较正常内膜组织明显增强,二者有统计学差异(P<0.05)。结论国内外首次应用cDNA-RDA法对EMs在位内膜及正常内膜组织进行三轮杂交,并获得了11个差异DNA片段。其中有4个与已知基因有高度同源性,并经过RT-PCR验证,证实侯选基因来自于mRNA水平,并初步筛查到一个与内异症发生相关的上调基因。