奥沙利铂长循环热敏脂质体质量检测方法学研究

论文摘要

抗肿瘤药物奥沙利铂在多种癌症的治疗中显示出良好的治疗效果,然而其在临床使用过程中易导致严重的毒性反应。为降低毒副作用、提高治疗效果,本实验室将奥沙利铂开发成奥沙利铂长循环热敏脂质体（Oxaliplatin Long-circulating Thermosensitive Liposomes,OLTL）。但是,目前国内外尚无热敏脂质体的质量标准研究体系。本文对制备的OLTL进行了奥沙利铂含量测定、溶血磷脂酰胆碱含量测定、杂质检查、包封率测定、热敏释放等检查方法学的研究,为OLTL的质量标准的建立打下基础。首先,分别建立了OLTL中奥沙利铂和溶血磷脂酰胆碱含量测定的液相色谱法（HPLC法）。奥沙利铂含量测定的色谱条件为：色谱柱,Megress C18（4.6mmx250mm,5μm）柱；流动相,甲醇-水（4：96,v/v）；检测波长,210nm；流速,1.0mL-min-1;进样体积,20μL。在方法学验证中,奥沙利铂浓度在50.24-150.72μg·mL-1范围内线性关系良好,相关系数为0.9993；重复性和中间精密度RSD分别为0.68%和0.92%；平均回收率为99.97%。溶血磷脂酰胆碱含量测定的色谱条件为：Venusil XBP-C8（4.6mm x250mm,5μm）柱及电雾式检测器（CAD）,以甲醇/水梯度洗脱,在方法学验证中,溶血磷脂酰胆碱在15.06-45.18μg·mL-1内线性关系良好,回收率为100.18%,精密度为0.53%。其次,建立了OLTL杂质A、杂质B、杂质C及其它杂质的色谱检测方法。杂质A测定的色谱条件为：色谱柱,Hypersil ODS2C18（4.6mmx250mm,5μm）;流动相,乙腈/磷酸盐缓冲液（15：85,v/v）；检测波长,205nm；流速,2.0mL·min-1；柱温,25℃。杂质B测定的色谱条件为：色谱柱,ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6mm×250mm,5μm）;流动相,乙腈-磷酸盐缓冲液（15：85,v/v）；检测波长,215nm；流速,2.0mL-min-1；柱温,40℃。杂质C和其它杂质的检测方法同奥沙利铂含量检测方法。在用建立的杂质检测方法对OLTL制备过程进行监测时发现,奥沙利铂在缓冲溶液中易水解造成,超声会造成杂质C的大量生成,挤压通过100nm聚碳酸酯膜时会造成其它杂质的增加。然后,建立了OLTL包封率测定的微柱离心方法,微柱离心方法为：柱高2cm,前六管洗脱溶剂为pH6.5的磷酸缓冲液,转速为1500rpm,7-16管洗脱溶剂为pH6.5PBS-甲醇（95：5,v/v）,转速为2000rpm。在方法学验证中：奥沙利铂浓度在1.01-50.06μg·mL-1线性关系良好,相关系数为0.999；重复性及中间精密度脂质体部分的RSD分别为1.55%和0.62%,游离药部分的RSD分别为1.40%和0.92%,加样回收率为99.08%；总药回收率为97.48%。最后,考察了OLTL在37℃和41.5℃加热条件下体外热敏释药特性。结果：OLTL在37℃条件下加热6h后释药率仅为5%,而在41.5℃条件下加热30min就可以释放出58%的药物,显示了良好的热敏释药特性。通过上述研究,提出了OLTL质量标准草案,经实践检验,表明所建立的分析方法良好,专属性强,灵敏度高,操作简便,能有效地用于OLTL的质量控制。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
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• 表格清单
• 第一章 前言
• 1.1 奥沙利铂
• 1.1.1 理化性质
• 1.1.2 作用机制
• 1.1.3 临床疗效
• 1.1.4 毒副作用
• 1.2 脂质体
• 1.2.1 长循环脂质体
• 1.2.2 热敏脂质体
• 1.2.3 长循环热敏脂质体
• 1.3 药物制剂质量标准的建立
• 1.3.1 脂质体质量研究内容的确立
• 1.3.2 脂质体方法学研究
• 1.3.3 脂质体质量标准的制定
• 1.3.4 脂质体质量标准的修订
• 1.4 本课题研究的目的和意义
• 1.5 本课题研究的内容
• 第二章 奥沙利铂长循环热敏脂质体含量测定方法的建立
• 2.1 仪器与材料
• 2.1.1 仪器
• 2.1.2 材料
• 2.2 奥沙利铂含量测定方法的建立
• 2.2.1 HPLC检测方法的优化与建立
• 2.2.2 系统适用性试验
• 2.2.3 方法学验证
• 2.2.4 含量测定方法的制定
• 2.2.5 放大三批OLTL含量测定结果
• 2.3 溶血卵磷脂含量测定方法的建立
• 2.3.1 检测方法的选择
• 2.3.2 色谱条件的选择
• 2.3.3 溶血磷脂酰胆碱（LPC）含量检测方法的方法学验证
• 2.3.4 溶血磷脂酰胆碱含量测定方法
• 2.3.5 溶血磷脂酰胆碱含量测定结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 奥沙利铂长循环热敏脂质体有关物质测定方法
• 3.1 仪器与材料
• 3.1.1 仪器
• 3.1.2 材料及试剂
• 3.2 方法与结果
• 3.2.1 奥沙利铂杂质A（草酸）分析方法的建立
• 3.2.2 奥沙利铂杂质B分析方法的建立
• 3.2.3 奥沙利铂杂质C及其它杂质分析方法
• 3.2.4 OLTL工艺杂质研究
• 3.2.5 奥沙利铂有关物质测定方法的制定
• 3.2.6 放大三批OLTL有关物质的检测
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 奥沙利铂长循环热敏脂质体包封率测定方法
• 4.1 仪器与材料
• 4.1.1 仪器
• 4.1.2 材料及试剂
• 4.2 方法与结果
• 4.2.1 葡聚糖凝胶微柱离心法原理
• 4.2.2 包封率测定方法的建立
• 4.2.3 包封率测定方法的方法学验证
• 4.2.4 三批OLTL包封率的检测
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 奥沙利铂长循环热敏脂质体热敏释药特性考察
• 5.1 仪器与材料
• 5.1.1 仪器
• 5.1.2 材料及试剂
• 5.2 方法与结果
• 5.2.1 OLTL相变温度的考察
• 5.2.2 OLTL体外释放
• 5.3 小结
• 参考文献
• 附录1 奥沙利铂长循环热敏脂质体质量标准草案
• 附录2 攻读学位期间所发表的学术论文
• 致谢