神经病理痛大鼠背根神经节神经细胞和脊髓背角血管内皮生长因子受体2及嘌呤2X2/3的相互作用研究

论文摘要

目的：神经病理痛（Neuropathic pain）是由外周或中枢神经系统结构损伤或功能紊乱所导致的病理性疼痛。实验室前期的研究工作已观察到神经病理痛模型大鼠背根神经节（dorsal root ganglia, DRG）神经细胞中血管内皮生长因子（VEGF）免疫反应性增强。鞘内应用抗重组血管内皮生长因子抗体（Anti-recombinant vascular endothelial growth factor antibody,简称Anti-rVEGF）可使神经病理痛模型大鼠后足的机械和热痛阈值降低,VEGFR-2、P2X3及P2X2/3受体表达减少。本研究进一步通过电生理方法观察在大鼠DRG神经细胞,VEGF对P2X3受体和P2X2/3受体激动剂激活电流的调制作用,并结合免疫组织荧光双标观察神经病理痛模型大鼠L4-6背根神经节细胞VEGFR-2、P2X2及P2X3受体共表达以了解相互之间关系；进而用免疫组织化学、免疫组织荧光双标和蛋白印迹分析方法观察神经病理痛模型大鼠L4/5段脊髓背角神经细胞VEGFR-2、P2X2和P2X3受体的相互关系,以期拓宽和深化对神经病理痛发病机理的认识,为防治神经病理痛提供新的靶点。方法：建立坐骨神经结扎损伤模型。SD雄性大鼠随机分为三组：假手术组（Sham group, A）,坐骨神经慢性压迫性损伤神经病理痛模型组（chronic constriction injury, CCI） （CCI+PBS group, B）和Anti-rVEGF处理神经病理痛模型组（CCI+Anti-rVEGF group, C）。C组每隔一天鞘内注射Anti-rVEGF抗体,A和B组同时间注射磷酸盐缓冲生理盐水。CCI术后第14天急性分离大鼠手术侧L4-6背根神经节和L4/5段脊髓背角,通过免疫组织化学、免疫组织荧光双标和蛋白印迹分析方法检测DRG神经细胞和L4/5段脊髓背角VEGFR-2、P2X2和P2X3的表达。应用全细胞膜片钳技术在大鼠新鲜分离的DRG神经细胞上记录VEGF对P2X3受体激动剂和P2X2/3受体特异性激动剂激活电流的调制作用。结果：免疫荧光双标结果显示三组背根神经节神经细胞VEGFR-2均分别有P2X2受体、P2X3受体免疫荧光共表达。B组与A组比较VEGFR-2和P2X2受体、P2X3受体荧光表达量更明显,经Anti-rVEGF抗体处理后,荧光亮度减弱,表达降低。膜片钳实验结果表明大部分DRG神经细胞外力ATP（1-1000μmol·L-1）,引起剂量依赖性的内向电流IATP,且随浓度增加IATP增大。P2X2/3受体特异性激动剂α,β-meATP可产生类似电流,该电流也能被P2X2/3受体特异性拮抗剂A-317491所抑制。预加VEGF,对ATP电流和α,β-meATP电流都有增强作用,此增强作用均可被VEGF拮抗剂vatalanib抑制。免疫组化结果显示B组L4/5脊髓背角的VEGFR-2、P2X2和P2X3的阳性细胞光密度值均高于A组和C组（p<0.05）；免疫荧光双标结果显示L4/5段脊髓背角VEGFR-2均分别有P2X2受体、P2X3受体免疫荧光共表达。B组与A组比较VEGFR-2和P2X2受体、P2X3受体荧光表达量更明显,经Anti-rVEGF抗体处理后,荧光亮度减弱,表达降低。蛋白印迹分析表明在目的条带经β-actin标化后C组L4/5脊髓背角的VEGFR-2、P2X2和P2X3的蛋白表达均明显低于B组（p<0.01）,但仍高于A组（p>0.05）。结论：神经病理痛模型大鼠背根神经节神经细胞和脊髓背角的VEGFR-2、P2X2和P2X3受体存在共表达并表达上调,电生理结果显示VEGF增大P2X3或P2X2/3受体激动剂激活电流。提示VEGFR-2与P2X3或P2X2/3受体在神经病理痛发病过程中存在相互协同作用,VEGF可增强P2X3或P2X2/3受体在神经病理痛中的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 溶液配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 实验动物分组
• 2.2.2 神经病理痛模型制作
• 2.2.3 鞘内注射
• 2.2.4 免疫组织化学
• 2.2.5 免疫组织荧光双标
• 2.2.6 全细胞膜片钳
• 2.2.7 蛋白印迹
• 2.2.8 统计学方法
• 第3章 结果
• 3.1 背根神经节神经细胞免疫组织荧光双标
• 3.2 背根神经节神经细胞膜片钳结果
• 3.2.1 DRG神经细胞P2X受体激动剂激活电流
• 3.2.2 VEGF对P2X受体激动剂激活电流的增强作用
• 3.2.3 VEGF增强IATP的浓度—效应关系
• 3.3 脊髓背角免疫组织化学
• 3.4 脊髓背角免疫组织荧光双标
• 3.5 脊髓背角蛋白印迹
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 综述
• 参考文献