新西兰兔卵母细胞体外成熟、体外受精及受精卵体外培养的研究

论文摘要

本实验以44只新西兰母兔为实验素材,主要研究兔卵巢表面卵母细胞体外成熟、体外受精以及受精卵的不同体外培养条件,以优化兔卵母细胞体外成熟、体外受精以及受精卵培养的体系,实验结果如下:1.采用切割法、针刺挤压法收集卵巢表面卵母细胞,检验不同采集方法对收集卵巢卵母细胞数量的影响。结果表明:针刺挤压法的所获得的卵母细胞数（23.63/只）显著高于切割法（16.50/只）（p<0.05）。2.比较添加不同浓度的FSH、LH对兔卵母细胞体外成熟的影响,结果表明: 1 U /mL FSH+2 U/mL LH的成熟率最高,达到46. 62 %,极显著高于对照组（TCM199+10 %FCS）的成熟率（13. 71 %,p<0.01）,显著高于高浓度组（10 U /mL FSH+20 U/mL LH）的成熟率（26.83 %,p<0.05）。3.比较了不同的成熟培养时间对卵母细胞成熟率的影响,以成熟培养液培养卵母细胞,分别在成熟培养24 h、30 h、36 h、40 h对部分卵母细胞用透明质酸酶处理后观察第一极体排出率,其余部分加精子观察受精率。培养24 h、30 h、36 h、40 h的成熟率分别为21.92 %、46.62 %、52.77 %、30.71 %,这就表明:成熟时间为30、36 h的成熟率显著高于成熟时间为24、40 h的成熟率（p<0.05）。4.以TCM199+FCS+FSH+LH+E2+丙酮酸钠为基础成熟培养液,分别添加50 ng/mL及100 ng/mL的EGF、10 ng/mL及20 ng/mL的SCF、10 ng/mL及20 ng/mL的LIF,然后比较了EGF、SCF及LIF对卵母细胞成熟率的影响。结果表明:50 ng/mL及100 ng/mL的EGF能显著地提高了卵母细胞成熟率（基础成熟培养液、添加50 ng/mL及100 ng/mL的EGF组的成熟率分别为49.04 %、61.39 %和65.79 %）。SCF对卵母细胞成熟率无明显影响（成熟率分别为54.17 %、50.00 %和45.83 %）,而LIF对卵母细胞成熟有明显的抑制作用（成熟率分别为54.19 %、12.50 %和4.17 %）。5.比较了上游法、直接洗涤法和Percoll密度梯度离心法三种精子处理方法对兔精子回收率及卵裂率的影响,三种方法的回收率分别为7.8 %、93.9 %、86.9 %,受精后的卵裂率分别为0 %、39.05 %、54.29 %,结果表明:Percoll密度梯度离心法是一种较理想的精子处理方法。6.比较了常规体外受精与显微注射卵裂率,结果显示,常规体外受精卵裂率（63.97 %）极显著高于显微注射卵裂率（25.65 %）（p<0.01）。7.比较了TCM199+10% FCS和DMEM+10 %FCS对胚胎（取自常规体外受精的2-细胞）发育的影响,结果表明两者之间无显著差异（p>0.05）。8.以TCM199+10 %FCS为基础的受精卵培养液,分别添加一定浓度的维生素C（100μmol/L）及β-巯基乙醇（50μmol/L）,然后比较了它们对胚胎（取自常规体外受精的2-细胞）发育的影响,表明结果,100μmol/L的维生素C及50μmol/Lβ-巯基乙醇对胚胎发育无显著影响（p>0.05）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 1 卵母细胞的体外成熟
• 1.1 COCs 的获取
• 1.2 卵母细胞的分类
• 1.3 卵母细胞成熟过程
• 1.4 卵母细胞成熟的分子调节机理
• 1.5 卵母细胞成熟的判断
• 1.6 影响卵母细胞体外成熟的因素
• 2 卵母细胞体外受精
• 2.1 受精过程
• 2.2 影响精子体外获能的因素
• 2.3 影响体外受精的因素
• 2.4 影响显微授精结果的因素
• 3 受精卵的体外培养及影响因素
• 4 研究目的和意义
• 第二章 兔卵母细胞体外成熟研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 卵巢不同处理方法对获卵数的影响
• 2.2 不同浓度的FSH、LH 对兔卵母细胞体外成熟的影响
• 2.3 不同成熟培养时间对兔卵母细胞体外成熟的影响
• 2.4 EGF 对兔卵母细胞体外成熟、体外受精的影响
• 2.5 SCF、LIF 对成熟率的影响
• 3 讨论
• 3.1 卵巢处理方法对获卵数的影响
• 3.2 不同浓度的FSH、LH 对兔卵母细胞体外成熟的影响
• 3.3 成熟时间对兔卵母细胞体外成熟的影响
• 3.4 EGF 对兔卵母细胞体外成熟的影响
• 3.5 SCF、LIF 对成熟率的影响
• 第三章 兔卵母细胞体外受精及受精卵体外培养的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.3 试验设计
• 1.4 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 不同精子处理方法的效果
• 2.2 体外受精与显微注射卵裂率的比较
• 2.3 M199 和DMEM 对胚胎发育的影响
• 2.4 维生素 C 及 β-巯基乙醇对胚胎发育的影响
• 3 讨论
• 3.1 不同精子处理方法的效果比较
• 3.2 体外受精与显微注射卵裂率的比较
• 3.3 M199 和DMEM 对胚胎发育的影响
• 3.4 维生素 C 及 β-巯基乙醇对胚胎发育的影响
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文