银耳菌丝与香灰菌丝相互作用关系的初步研究

论文摘要

本文以银耳（Tremella fuciformis）菌丝和香灰（Hypoxylon sp.）菌丝为材料,从三个方面研究了这两种菌丝之间的相互作用关系:（1）利用光学显微镜、扫描电子显微镜观察它们的菌丝及菌丝特殊结构的形态特点,并将这两种菌丝与7种真菌菌丝进行两两配对培养,揭示它们菌丝相互作用的形态差别。（2）检测银耳菌丝、香灰菌丝和二者的混合培养菌丝,在PDB培养基和木屑培养基中的生长过程中,胞外纤维素酶（内切β-1,4葡聚糖酶、外切β-1,4葡聚糖酶和β-1,4葡糖苷酶）、木聚糖酶、多酚氧化酶、漆酶、几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶的活性变化;并研究了香灰菌丝胞外黑色素对银耳菌丝多酚氧化酶的影响。（3）以纯培养的银耳菌丝以及同香灰菌丝共培养的银耳菌丝为材料,采用RAP-PCR技术分析银耳菌丝在这两种培养情况下基因的差异表达。主要研究结果如下:1.光学显微镜和扫描电子显微镜观察发现银耳菌丝末端膨大、扭曲结构多,锁状联合结构明显可见;香灰菌丝稀疏、细长且直,无锁装联合结构。银耳菌丝有大量明显可见的吸器细胞结构,在两者混合菌丝中,银耳菌丝吸器细胞吸附大量菌丝,其形态特点类似香灰菌丝;在配对培养中,可以发现银耳菌丝与7种真菌菌丝生长竞争处于劣势,而香灰菌丝可以通过分泌黑色素来同这7种菌丝进行对抗,拥有较强的生存竞争能力;银耳同香灰菌丝混合培养,银耳菌落有“吐黄水”和边缘出现“白毛团”的现象。2.银耳菌丝在木屑培养基中没有明显生长迹象。银耳菌丝的三种纤维素降解酶的活性都低于香灰菌丝,在PDB培养基和木屑培养基中,混合培养时外切β-1,4葡聚糖酶活性最大值为122.5U和502.1U,要明显高于香灰菌丝和银耳菌丝的纯培养时的最大值,说明混合菌丝在一定程度上有相对较高的降解纤维素的能力;银耳菌丝、香灰菌丝及混合培养菌丝的木聚糖酶活性相对于纤维素酶均比较高,混合培养时酶活在木屑培养基中最大值为923.9U,明显高于香灰菌丝836.1U;香灰有一定的多酚氧化酶活性却没有漆酶活性,银耳漆酶活性在PDB培养基中最大值为18.5U,而混合培养时酶活没有明显提高,其最大值为21.5U,说明银耳菌丝、香灰菌丝及二者混合菌丝分解利用木质素的能力较差;在PDB培养基中混和培养时几丁质酶活性略高于银耳菌丝,而香灰菌丝该酶活性相对最低;β-1,3葡聚糖酶活性在银耳菌丝、香灰菌丝及二者混合菌丝中差异不大,说明银耳菌丝没有很强的降解真菌细胞壁的能力。在含0.05g/L的香灰菌丝胞外黑色素的PDB培养基中,银耳菌丝多酚氧化酶活性在第15d达到最大值156.3U,高于空白对照和其它浓度下的活性值。3.提取纯化银耳菌丝在两种培养条件下的总RNA,并将RNA浓度定量为1μg/mL。使用6条随机引物进行RAP-PCR,经PAGE胶分离得到12条差异片段。使用相应的引物和程序重扩增后,将9个扩增效率高且产物较纯的PCR产物进行克隆,测序,并于GenBank中用BLAST分析测序结果,经Northern杂交验证,发现Seq1为差异表达的基因。Seq1序列与新型隐球酵母（Cryptococcus neoformans var.neoformans）中的一个未知的保守蛋白序列有很高的同源性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 部分英文缩写说明
• 第一章 文献综述
• 1.1 银耳菌的研究进展
• 1.1.1 银耳菌的分类地位和生态分布
• 1.1.2 银耳菌的生活史
• 1.1.3 银耳菌在生活史各个阶段形态学的研究
• 1.1.4 银耳菌的二型态现象及相关研究
• 1.1.5 银耳菌的应用价值
• 1.2 香灰菌的研究进展
• 1.2.1 香灰菌的分类地位
• 1.2.2 香灰菌形态及生长特点
• 1.2.3 香灰菌的生理生化研究
• 1.3 银耳菌与香灰菌的相互关系研究进展
• 1.3.1 银耳菌同香灰菌伴生现象的发现
• 1.3.2 银耳菌同香灰菌的胞外酶水平研究
• 1.3.3 银耳菌同香灰菌"同住"关系的提出
• 1.3.4 银耳菌同香灰菌"寄生"关系的提出
• 1.4 存在于银耳属中的寄生关系研究简介
• 1.4.1 银耳属中真菌寄生真菌
• 1.4.2 银耳属中寄生关系的特点
• 第二章 银耳菌丝与香灰菌丝相互作用的形态学研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 银耳菌丝、香灰菌丝菌种的活化
• 2.2.2 银耳菌丝、香灰菌丝及其混合菌丝的光学显微镜观察
• 2.2.3 银耳菌丝、香灰菌丝及其混合菌丝的扫描电镜观察
• 2.2.4 银耳菌丝、香灰菌丝与几种真菌的配对培养观察
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 光学显微镜下银耳菌丝与香灰菌丝的形态
• 2.3.2 扫描电子显微镜观察银耳菌丝与香灰菌丝的形态及特殊结构
• 2.3.3 银耳菌丝及香灰菌丝同7种真菌在共培养的形态变化及差异
• 2.4 结论与讨论
• 第三章 银耳菌丝与香灰菌丝相互作用的胞外酶活研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌种培养及生长观察
• 3.2.2 胞外酶的提取及处理
• 3.2.3 三种纤维素酶活性测定
• 3.2.4 木聚糖酶的酶活测定
• 3.2.5 多酚氧化酶的酶活测定
• 3.2.6 漆酶活性测定
• 3.2.7 几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶活性测定
• 3.2.8 香灰菌胞外黑色素对银耳菌丝多酚氧化酶活的影响试验
• 3.2.9 数据统计分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 两组实验中银耳及香灰菌丝的生长状态
• 3.3.2 两组实验中的内切β-1,4葡聚糖酶活性变化
• 3.3.3 两组实验中的外切β-1,4葡聚糖酶活性变化
• 3.3.4 两组实验中的β-1,4葡萄糖苷酶活性变化
• 3.3.5 两组实验中的木聚糖酶活性变化
• 3.3.6 两组实验中的多酚氧化酶活性变化
• 3.3.7 两组实验中的漆酶活性变化
• 3.3.8 两组实验中的几丁质酶活性变化
• 3.3.9 两组实验中的β-1,3葡聚糖酶活性变化
• 3.3.10 香灰菌胞外黑色素对银耳菌丝多酚氧化酶的影响
• 3.4 结论与讨论
• 第四章 银耳与香灰菌相互作用的差异表达基因研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 主要试剂及制备
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 材料培养
• 4.2.2 RNA提取及纯化
• 4.2.2 cDNA第一链的合成
• 4.2.3 RAP-PCR扩增
• 4.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色
• 4.2.5 条带回收、重扩增及纯化
• 4.2.6 差异片断的克隆
• 4.2.7 差异片断的测序及分析
• 4.2.8 Northern杂交分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 RNA提取及纯化结果
• 4.3.2 RAP-PCR差异显示分析
• 4.3.3 差异片段的重扩增、克隆与鉴定结果
• 4.3.4 差异片段的序列分析及BLAST比对结果
• 4.3.5 Northern杂交结果
• 4.4 结论与讨论
• 主要结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录