论文题目: 猪抵抗素、脂联素和脂联素受体基因的克隆和分子特征
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 戴梦红
导师: 杨在清
关键词: 抵抗素,脂联素,脂联素受体,脂肪组织,组织分布,杂交,染色体定位
文献来源: 华中农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 脂肪组织不仅是储藏及供给能量的场所，而且还是一个代谢十分活跃，功能复杂的内分泌器官，它能分泌许多脂肪细胞因子(Adipocytokines)，包括肿瘤坏死因子—α(tumor necrosis factor—α，TNFα)、瘦素(leptin)、白介素—6(interleukin—6，IL-6)、脂联素(adiponectin)和抵抗素(resistin)等。这些脂肪细胞因子通过内分泌或旁分泌方式对全身各器官系统功能具有重要调节作用，特别是参与调节与肥胖相关的胰岛素抵抗和葡萄糖代谢紊乱。胰岛素抵抗也即胰岛素生理作用减弱，是多数2型糖尿病的主要的病理生理缺陷，往往与肥胖密切相关。 抵抗素(resistin)和脂联素(adiponectin)是近来发现的两个最为典型的脂肪细胞因子。Resistin的重要生理作用就是将肥胖与胰岛素抵抗联系起来。对resistin进一步深入研究对于预防、检测和治疗2型糖尿病具有重要指导意义。Adiponectin由脂肪细胞分泌后进入血液，以多种形式在血液中循环。脂联素球状区在体内独立存在，与完整的脂联素功能相似。脂联素能够促进肌肉脂肪酸氧化、降低血浆甘油三酯、通过增强胰岛素的敏感性而促进葡萄糖代谢。另外，脂联素在抗心血管疾病方面也发挥着重要作用。 本文以梅山猪为研究对象，以半定量RT-PCR、Western Bloting和辐射杂种细胞板技术等方法，对抵抗素、脂联素以及脂联素受体进行了基因克隆、表达及染色体定位等研究，取得了如下结果： 1．利用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)的方法得到了猪resistin cDNA的5’和3’末端，通过拼接得到全长535bp的resistin cDNA序列；利用PCR的方法得到了resistin的全长DNA序列，并对其基因组结构进行分析。结果显示猪resistin cDNA序列含330bp的开放阅读框，编码109aa，分子量为12kDa，推导的氨基酸序列与人resistin氨基酸序列具有75.2％的同源性。猪resistin基因由四个外显子组成，与人resistin基因具有相同的外显子结构，而与小鼠resistin基因结构差异较大。
论文目录:
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.Resistin研究进展
1.1 Resistin的发现
1.2 Resistin基因结构
1.3 Resistin蛋白质结构特征
1.4 Resistin的组织分布
1.5 Resistin样分子家族(RELMs)
1.6 Resistin的生物学功能
1.6.1 Resistin与肥胖相关的胰岛素抵抗
1.6.2 Resistin与炎症反应
1.6.3 Resistin对葡萄糖的调控作用
1.7 小结
2.脂联素及其受体研究进展
2.1 脂联素的发现
2.2 脂联素基因
2.3 脂联素蛋白质结构多态性
2.4 体内脂联素的表达调控
2.5 脂联素的功能
2.5.1 脂联素对葡萄糖和脂代谢的调控作用
2.5.2 脂联素与动脉粥样硬化
2.6 脂联素受体
2.7 小结
3.研究目的和意义
第二章 猪抵抗素基因的克隆和表达研究
1.前言
2.实验材料与试剂
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 样品采集
2.1.3 菌株及质粒
2.2 主要仪器、试剂及溶液配制
2.2.1 主要仪器
2.2.2 主要试剂
2.2.3 主要溶液配制
3.实验方法
3.1 血液白细胞的分离与纯化
3.2 血液白细胞总DNA提取
3.3 血液白细胞／组织样品总RNA提取
3.4 总RNA纯化
3.5 总RNA含量及纯度鉴定
3.6 SDS-PAGE和Western杂交
3.7 目标片段的扩增与纯化
3.7.1 引物设计
3.7.2 全长resistin cDNA的扩增
3.7.3 全长resistin DNA的扩增
3.8 猪resistin mRNA的组织分布
3.9 兔抗猪resistin多克隆抗血清的制备
3.9.1 原核表达载体的构建与鉴定
3.9.2 重组蛋白质表达
3.9.3 包涵体提取与重组蛋白质的纯化和鉴定
3.9.4 抗血清的制备
3.9.5 抗血清的效价检测(ELISA法检测)
3.9.6 抗血清的Western blotting检测
3.9.7 抗血清的纯化
3.10 猪血液样品中天然resistin蛋白的检测
3.11 数据统计分析
4.结果与分析
4.1 猪resistin全长cDNA的克隆
4.2 猪resistin全长基因的克隆
4.3 猪resistin mRNA的组织分布
4.3.1 PCR扩增指数期循环数的确定
4.3.2 组织表达谱分析
4.4 兔抗猪resistin多克隆抗血清的制备
4.4.1 表达载体的构建与鉴定
4.4.2 重组蛋白质的表达
4.4.3 重组蛋白质的纯化与鉴定
4.5 兔抗猪多克隆抗血清的检测
4.6 猪血液样品中天然resistin蛋白的检测
5.讨论
第三章 猪脂联素及其受体基因的克隆、表达及染色体定位研究
1.前言
2.实验材料与试剂
2.1 实验动物和样品采集
2.2 主要仪器、试剂及溶液配制
3.实验方法
3.1 总DNA提取
3.2 总RNA提取和纯化
3.3 猪脂联素及其受体基因片段的扩增
3.3.1 引物设计
3.3.2 PCR扩增条件
3.4 猪脂联素及其受体的染色体定位
3.4.1 引物设计
3.4.2 PCR扩增
3.4.3 数据分析
3.5 猪脂联素及其受体基因的组织分布
3.6 猪脂联素受体1基因内含子的扩增
4.结果与分析
4.1 猪脂联素及其受体基因片段的分离、序列分析与鉴定
4.1.1 猪脂联素及其受体基因片段的分离
4.1.2 基因组片段的序列分析与鉴定
4.2 猪脂联素及其受体基因染色体定位结果分析
4.3 猪脂联素及其受体基因的组织分布
4.4 猪脂联素受体1基因组片段的扩增及其基因组结构分析
5.讨论
结论与创新点
1.结论
2.创新点
参考文献
研究生期间论文发表情况
致谢
发布时间: 2006-12-12
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