siRNA特异性沉默BC047440基因对HepG2肝癌细胞生长特性影响的研究

论文摘要

背景:原发性肝癌和其他肿瘤一样,已被证实为一种基因病。寻找在肝癌组织中高表达,并在其增殖中起关键作用的新基因,为肝癌基因治疗以及提供分子靶点上有着重要意义。在先前的研究中,我们运用多组织Northern杂交证实BC047440基因表达总趋势是在肿瘤组织中增强。此外,在随后的RT-PCR实验中也已证明其在肝癌组织中表达强度明显高于与其相对应的癌旁肝组织。从而初步证实BC047440基因可能是一个与肝癌的发生、发展相关的基因。因此,利用RNAi技术,通过抑制BC047440基因的表达,研究肝癌细胞株HepG2受干扰后的一系列生长特性的影响,从而揭示BC047440基因在肝癌的发生、发展中所起的作用。RNAi是生物界广泛存在的保守的防御反应。它是一个多步骤、多因子参与的复杂过程,它比反义核苷酸和核酶技术能更高效的抑制目的基因的表达。人们推测可能分为以下阶段:首先双链RNA在细胞内被RNA酶Ⅲ（RibonuclaseⅢ, RNaseⅢ）酶切成约2123nt的小片段干扰RNA （short interfering RNA, siRNA）,siRNA与DNA内切酶、外切酶、解旋酶以及其他一些蛋白组装形成siRNA-蛋白复合物,即RNA诱导沉默复合体（RNA-inducedsilencing complex, RISC）。RISC通过识别目的基因mRNA,并与之结合将其降解。本研究通过自行构建能在细胞内转录出功能性siRNA的载体,并将其用于干扰BC047440基因的表达,为下一步基因功能和治疗手段的研究奠定基础。目的:RNAi是近年广泛应用的新技术,它能明显抑制目的基因的表达。已有研究证实化学合成的siRNA能高效地介导RNAi作用,但作用持续时间短,而采用siRNA表达载体（small interfering RNA expression vector）的方法能延长作用时间[1-5]。因此本实验用靶BC047440基因的siRNA与具有荧光蛋白表达的pGenesil-1质粒连接,构建针对BC047440基因的siRNA重组质粒,并将之稳定转染入肝癌细胞中,在此基础上,探索BC047440-siRNA对肝癌细胞增殖、周期及凋亡影响,探讨BC047440-siRNA作为肝癌的基因治疗新策略的可行性。方法:1.利用生物信息学技术在线设计特异性的BC047440-siRNA寡核苷酸片段,在体外构建和克隆BC047440-siRNA表达载体（pGenesil-1-BC047440 -siRNA）;2.利用脂质体将BC047440-siRNA表达载体及阴性对照质粒（pGenesil-1）分别转染入HepG2肝癌细胞中,通过G418筛选,建立稳定转染的细胞模型,分别命名为PP2组及PP1组,未处理的HepG2细胞组命名为PP0组;3.干扰后运用相对荧光定量PCR检测BC047440基因在mRNA表达水平;4.分别用CCK-8、平板克隆形成实验检测干扰后细胞增殖曲线及单个HepG2细胞的增殖情况,并通过Hochest33342染色法对肿瘤细胞染色后,观察细胞核的形态变化,从而在形态学上了解干扰BC047440基因表达后是否能引起HepG2细胞凋亡,最后用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡的变化。结果:1.经序列分析、酶切电泳证明构建的针对BC047440基因的shRNA重组粒质粒构建成功;2.将BC047440-siRNA表达载体及阴性对照质粒（pGenesil-1）分别转染入HepG2肝癌细胞后经G418筛选成功获得PP1、PP2组抗性克隆;3.经realtime PCR检测PP2组与亲本细胞PP0组相比较BC047440基因mRNA水平明显降低,抑制率约为75%;4. CCK-8细胞增殖实验中PP2组细胞在第二天开始增殖能力明显降低,平板克隆形成实验发现PP2组克隆形成率为:[（8.420±0.82）%],明显低于PP1组[（39.31±5.39）%]及PP0[（40.96±3.21）%] （p <0.01）;Hochest33342凋亡实验显示各组细胞核染色均匀,未发现细胞核出现核浓缩、边聚等凋亡形态变化。流式细胞仪检测细胞周期可见:S期PP2组细胞计数百分比明显高于两对照组（p <0.05）,PP1及PP0两对照组之间无明显差别（p >0.05）。结论:设计合成的shRNA干扰序列准确无误地克隆到pGenesil-1表达载体中,针对BC047440基因的siRNA表达载体构建成功。该重组载体可特异、高效地干扰HepG2细胞内源性BC047440基因的表达,并可以抑制肝癌HepG2细胞的增殖,随后的Hochest33342实验,各实验组中未发现HepG2细胞有明显的凋亡形态改变,从而提示干扰BC047440基因所引起的肝癌细胞增殖抑制不是通过促进细胞凋亡这条途径。而流式细胞术的检查,发现干扰后肝癌HepG2细胞大部分滞留于S期,从而提示BC047440基因可能控制了细胞周期的进程,影响细胞进入分裂期,从而使细胞增殖停滞。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 siRNA 特异性沉默BC047440 基因对HepG2肝癌细胞生长特性影响的研究
• 前言
• 第一部分 siRNA 表达载体的构建及其鉴定
• 引言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 图片
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 RNAi BC047440 基因对HepG2细胞生长特性影响的研究
• 引言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 图片
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 文献综述 RNA 干扰技术及其在肝癌治疗中的进展
• 参考文献
• 研究生期间发表的文章
• 研究生期间参加会议