论文摘要
人白介素-11（Interleukin-11,IL-11）是分子量为21 kD的蛋白,具有造血调控,促进血小板生成等作用。为提高IL-11在体内的半衰期,研究室已构建了携带有HSA-IL-11融合蛋白编码基因的质粒pPIC9K-HSA-IL-11,并在Pichia pastoris GS115中成功表达,但存在表达量低,降解严重的问题,该菌株生产潜力不大。本课题建立了一种筛选HSA融合蛋白高表达转化子的方法,并应用该方法筛选得到2株不同宿主的HSA-IL-11表达菌株,P. pastoris GS115-HSA-IL-11、P. pastoris SMD1168-HSA-IL-11,比较发现GS115菌株更适合表达本融合蛋白,产量高达178 mg/L,经优化后摇瓶表达量为220 mg/L,经过对两种不同转化子的发酵上清进行western blot验证,结果显示表达产物为完整的HSA-IL-11蛋白。在5 L发酵罐上进行工艺放大,讨论了发酵培养基的不同氮源,发酵诱导阶段的甲醇流加方式,诱导阶段的培养基pH值及诱导温度等对目的蛋白表达的影响。最终确立工艺为:使用有机氮源作为发酵培养基,采用连续式的甲醇流加方式,诱导培养基的pH值为6.0,诱导温度降至20℃,此时降解得到一定程度的控制。最后对融合蛋白HSA-IL-11的纯化条件进行摸索,超滤浓缩后,通过染料亲和层析层析、疏水层析和阳离子交换层析三步,可得到纯度大于90%的HSA-IL-11融合蛋白纯品,纯化过程的总回收率约为17%。经测定其生物学活性为1.15×105 AU/mg。
论文目录
摘要Abstract第一章 绪论1.1 研究背景1.1.1 细胞因子1.1.2 白介素家族与IL-111.1.3 IL-11 的生物学作用及临床作用1.2 长效药物与长效IL-11 的研究1.2.1 构建长效药物的途径1.2.2 长效IL-11 的途径1.2.3 长效药物未来市场的展望1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统1.3.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的开发及利用1.3.2 巴斯德毕赤酵母表达系统的优势及不足1.3.3 几种毕赤酵母表达系统宿主菌及表达载体1.3.4 提高外源蛋白表达量的几种策略1.4 本课题研究基础和内容1.4.1 课题的研究基础和主要问题1.4.2 研究思路和内容第二章 材料与方法2.1 材料与方法2.1.1 菌种2.1.2 试剂与仪器2.1.3 培养基2.2 培养方法2.2.1 G418 抗性平板筛选高拷贝重组子2.2.2 免疫学方法的建立2.2.3 高表达菌株western blot 检测2.2.4 毕赤酵母工程菌摇瓶表达HSA-IL-11 单因素优化2.2.5 5 L 及30 L 发酵罐发酵条件的建立2.2.6 融合蛋白HSA-IL-11 的分离纯化2.2.7 分析与测定方法2.2.8 HSA-IL-11 生物学活性鉴定第三章 结果与讨论3.1 融合基因的转化3.1.1 线性化重组质粒pPIC9K-HSA-IL-11 的获得3.1.2 影响电转化效率的几个因素3.2 转化子的筛选3.2.1 先使用HSA 抗体筛选再使用IL-11 抗体复筛3.2.2 先使用IL-11 抗体筛选再使用HSA 抗体复筛3.2.3 不同显色强度菌株表达量的测定3.2.4 高表达菌株的western blot 鉴定3.2.5 G418 抗性平板得菌株表达量的测定以及与免疫法的比较3.2.6 GS115-HSA-IL-11 和SMD1168-HSA-IL-11 高表达重组子的筛选3.3 摇床培养条件研究3.3.1 重组菌的生长曲线及表达曲线3.3.2 工程菌表达HSA-IL-11 诱导条件的单因素分析3.4 发酵罐培养条件的研究3.4.1 不同氮源对工程菌的生长及表达的影响3.4.2 不同甲醇流加方式对工程菌的生长及表达的影响3.4.3 不同诱导pH 值对工程菌的生长及表达的影响3.4.4 不同诱导温度对工程菌生长及表达的影响3.5 HSA-IL-11 的分离纯化3.5.1 发酵液的超滤层析3.5.2 染料亲和层析3.5.3 疏水作用层析3.5.4 阳离子交换柱3.5.5 纯化步骤总结3.5.6 纯化后融合蛋白的western blot 鉴定及银染结果3.6 融合蛋白HSA-IL-11 的生物学活性测定结论与展望致谢参考文献附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文
相关论文文献
标签：人白介素论文; 免疫法论文; 融合蛋白论文; 低温诱导论文;
