乙肝表面抗原（HBsAg）基因转化番茄的研究

论文摘要

乙型肝炎（hepatitis B virus）是严重危害人类健康的常见病。预防和控制乙型肝炎感染最主要的措施是接种疫苗,目前广泛地采用注射疫苗,但存在成本高,贮运过程需要冷链,注射接种需要特定的卫生机构及专业医务人员等诸多问题,因此,研制经济方便的新型乙肝疫苗是全球控制乙型肝炎的现实要求。植物基因工程技术的不断成熟为新型疫苗的研究提供了新的思路。转基因植物产生的疫苗,可由人体简单摄食含该种疫苗的植物组织,通过刺激机体粘膜的特异性免疫应答,使人体获得较持久的疾病防御能力。由于成本低廉、无需冷藏、无需一次性针头、使用方便,因此,“植物口服疫苗”得到了世界卫生组织（WHO）的提倡,开展这方面的研究对推动全球免疫计划的实施具有重要的意义。根据目前国内外的转基因植物作为疫苗生产系统的研究中发现,抗原基因的表达量较低,导致转基因植物口服疫苗的免疫原性低,可能引起免疫耐受等诸多问题,抗原表达量不高已成为目前转基因植物口服疫苗不能产业化的瓶颈,因此需要进一步提高抗原表达量。有研究表明利用组织特异性启动子调控基因的表达,使重组蛋白在植物中的表达具有器官或组织特异性,可大大提高外源蛋白的表达量。本研究采用巢式PCR技术从番茄基因组DNA克隆到长度1.3kp的果实特异性2A11启动子基因。序列分析表明,克隆到的基因序列2A11启动子转录起始位点上游的621bp处缺失了已报道的番茄2A11启动子基因（GenBank ID M87659,1993）序列中的“tatattgttaacttcttgttgaattaaagcaat”片段,其同源性为61%,登入GenBank,ID号为DQ453963;构建瞬时植物表达载体pCAMBIA2A11,用农杆菌EHA105或AGL-1。介导侵染番茄果实,GUS基因瞬间表达结果表明,该2A11启动子基因具有驱动GUS基因在番茄果实中特异性表达的功能。本研究将乙型肝炎表面抗原（HBsAg）基因插入植物双元表达载体pCAMBIA1301中,由自行克隆鉴定的番茄果实特异性2A11启动子驱动,得到植物表达载体p2A111301-HBs;及由番茄果实特异性2A11启动子和花椰菜花叶病毒（CaMV35S）启动子双驱动,得到植物表达载体pCAM2A11-HBs。其选择性标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因,Tnos为终止子,?为增强子,以GUS基因为报告基因。建立番茄高频再生体系需要从培养基的激素配方（T1, T2, T3, T4, T5）、番茄不同外植体（子叶、下胚轴）的选择等方面进行番茄再生体系的优化。通过比较微型番茄“MICRO-TOM”子叶、胚轴和叶片对农杆菌的敏感性以及组培中的发芽率,最终选择子叶作为受体材料,其分化率和分化的不定芽的质量均明显优于胚轴和叶片。以含质粒pCAM2A11-HBs、p2A111301-HBs、及本室已构建保存的由组成型启动子CaMV35S驱动HBsAg的植物载体p1301HBs（均含有GUS基因）的根癌农杆菌侵染番茄外植体,以GUS瞬时表达效率为指标,系统研究了预培养时间、共培养条件、筛选条件等对转化率的影响的基础上建立、优化了微型番茄“Micro-tom”品种的遗传转化体系。结果表明外植体子叶预培养2d;活化后农杆菌稀释后浓度为OD6000.1,侵染5min;农杆菌侵染后暗光下共培养2d;筛选剂潮霉素（Hyg）浓度为20mg/L;在共培养基中加入100umol/L的AS,可大大提高了GUS瞬时表达率;经过脱菌处理后的材料应先恢复培养1周再加压筛选,有利于提高转化效率。将带有HBsAg-s的微型Ti质粒通过农杆菌介导分别转入微型番茄中,通过潮霉素加压筛选试验,结果选择20mg/L的潮霉素浓度作为转基因植株芽分化选择压力,选择25mg/L的潮霉素浓度作为转基因植株生根选择压力。得到转pCAM2A11-HBs番茄株系,转p2A111301-HBs,p1301-HBs的抗性愈伤刚刚开始分化抗性芽。获得的转化植株经GUS报告基因检测及PCR、Southern杂交检测,证实目的基因已整合到微型番茄“Micro-tom”的基因组中。ELISA检测结果表明在转基因番茄叶片中表达的HBsAg具有免疫活性,测得其表达量为385～891ng/g鲜重,占总可溶性蛋白（TSP）的0.0032～0.007%。由于时间关系,还不能检测转基因番茄果实中表达的HBsAg的免疫活性及表达量。目前已种植的转HBsAg基因植株35株。小番茄（Cherrytomato）是近年来新兴的小型蔬果,其营养价值高,可食性好、被普遍作为生食水果,微型番茄“Micro-tom”体型小,生长周期短,一年可种四代,具有发展为口服疫苗的良好潜力。本研究采用自行克隆鉴定的番茄果实特异性2A11启动子,以及用2A11-CaMV35S双启动子,驱动乙型肝炎病毒表面抗原小蛋白（HBsAg-s）,转化微型番茄“Micro-tom”,筛选鉴定获得转基因番茄植株,期望获得较高表达量的番茄转化株系,为研制乙型肝炎转基因番茄口服疫苗,提供了一些实验、理论指导。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 植物反应器生产药用蛋白的研究进展
• 1.1 转基因植物生产药用蛋白的优点
• 1.2 转基因植物生产药用蛋白的基本方法
• 1.2.1 稳定表达系统
• 1.2.2 暂态表达系统
• 1.3 植物表达系统的选择
• 1.4 转基因植物生产药用蛋白的研究进展
• 1.4.1 利用转基因植物生产抗体
• 1.4.2 利用转基因植物生产疫苗
• 1.4.3 利用转基因植物生产其它药物蛋白
• 1.5 利用转基因植物生产医药蛋白研究中存在的问题和解决方法
• 1.5.1 外源蛋白表达量问题
• 1.5.2 外源蛋白的下游加工问题
• 1.6 展望
• 2 植物基因工程疫苗的研究进展
• 2.1 转基因植物疫苗免疫特点研究
• 2.2 植物口服疫苗的发展现状
• 2.2.1 病毒性抗原
• 2.2.2 细菌性抗原
• 3 乙型肝炎病毒疫苗的研究进展
• 3.1 HBV 的分子生物学
• 3.2 HBV 疫苗的研究进展
• 4 番茄果实特异性启动子的研究进展
• 4.1 番茄E8 基因启动子
• 4.2 番茄2A11 基因启动子
• 5 本研究的目的、意义和研究内容
• 5.1 目的意义
• 5.2 研究内容
• 第二章 番茄果实特异性启动子的克隆及功能鉴定
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌体和质粒
• 1.3 仪器设备
• 1.4 工具酶
• 1.5 主要的化学试剂、试剂盒
• 1.6 常用溶液及培养基配制
• 2 方法
• 2.1 番茄果实特异性启动子2A11 基因的克隆
• 2.1.1 番茄总DNA 的提取
• 2.1.2 引物的设计与合成
• 2.1.3 巢式PCR 扩增
• 2.1.4 回收目的片段
• 2.1.5 目的片段的克隆
• 2.1.6 感受态E.coli DH5α的制备
• 2.1.7 连接物转化大肠杆菌E.coli DH5α
• 2.1.8 碱裂解法小量快速质粒提取
• 2.1.9 酶切鉴定
• 2.2 2A11 启动子的功能鉴定
• 2.2.1 瞬时植物表达载体的构建
• 2.2.2 PCR 鉴定法鉴定pCAMBIA2A11 质粒
• 2.2.3 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.4 用低温冷冻法直接转化农杆菌
• 2.2.5 农杆菌转化子的鉴定
• 2.2.6 根癌农杆菌介导的GUS 瞬时表达
• 3 结果
• 3.1 樱桃番茄基因组 DNA 的提取
• 3.2 PCR 结果
• 3.3 2A11- pMD18-T 重组质粒的鉴定
• 3.4 测序及序列分析结果
• 3.5 GenBank 登陆
• 3.6 启动子驱动GUS 基因在番茄果实组织中的瞬时表达
• 第三章 乙型肝炎表面抗原基因植物表达载体的构建
• 1 材料
• 1.1 菌种与质粒
• 1.2 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 植物双元表达载体的构建
• 2.1.1 质粒的小量提取（碱裂解法）
• 2.1.2 限制性内切酶的反应体系
• 2.1.3 回收目的片段
• 2.1.4 连接反应
• 2.1.5 植物双元载体的构建
• 2.1.6 感受态E.coli DH5α的制备
• 2.1.7 连接物转化大肠杆菌E.coli DH5α
• 2.1.8 植物双元表达载体的酶切鉴定
• 2.1.9 植物表达载体中番茄特异启动子和目的基因HBsAg 的测序鉴定
• 2.2 双元质粒载体转化农杆菌
• 2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.2 用低温冷冻法直接转化农杆菌
• 2.2.3 农杆菌转化子的鉴定
• 3 结果
• 3.1 双元质粒载体的构建与鉴定
• 3.2 双元载体系统微型Ti 质粒转化农杆菌及转化子的鉴定
• 第四章 农杆菌介导番茄的遗传转化
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌体
• 1.3 仪器设备
• 1.4 主要的化学试剂、试剂盒
• 1.5 常用溶液及培养基配制
• 1.6 番茄培养基类型
• 2 方法
• 2.1 番茄离体培养再生方法
• 2.2 番茄遗传转化体系的建立和优化
• 2.2.1 不同培养基对愈伤组织和不定芽形成的影响
• 2.2.2 番茄对抗生素的敏感性试验
• 2.2.3 农杆菌介导番茄转化基本流程及抗性苗筛选
• 2.3 转化体鉴定
• 2.3.1 GUS 基因瞬时表达检测
• 2.3.2 GUS 基因的稳定表达检测
• 2.3.3 聚合酶链式反应扩增（PCR）法检测外源基因的整合
• 2.3.4 Southern 杂交检测目的基因的整合
• 2.3.5 植物蛋白抗原活性的 ELISA （ 双抗体夹心法） 检测
• 3 结果与分析
• 3.1 番茄遗传转化体系的建立和优化
• 3.1.1 外植体组培形态变化
• 3.1.2 不同培养基对愈伤组织和不定芽形成的影响
• 3.1.3 番茄外植体对抗生素的敏感性试验
• 3.1.4 番茄转化方法的优化
• 3.1.5 优化后的转化流程
• 3.1.6 抗性苗的获得
• 3.2 外源基因整合、表达的检测
• 3.2.1 报告基因（GUS）检测结果
• 3.2.2 目的基因PCR 检测
• 3.2.3 Southern 杂交
• 3.2.4 转基因植株中目的基因表达活性及表达量的检测
• 4 转基因植物的扩繁与移栽
• 第五章 讨论
• 1 植物表达载体的构建
• 2 植物基因转化及外源基因在植物中的表达情况
• 2.1 影响转化因素的改进
• 2.2 嵌和体现象
• 2.3 假转化体的产生
• 2.4 试管苗的玻璃化现象
• 3 转基因植物疫苗研究中普遍存在的问题和解决方法
• 3.1 存在问题
• 3.2 解决对策
• 4 番茄作为乙型肝炎植物口服疫苗的前景
• 第六章 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 致谢