长江口、东海沉积环境细菌多样性和邻近西太平洋海域多环芳烃降解菌研究

论文摘要

第一部分长江口及其邻近海域沉积环境细菌多样性研究河口是一个复杂而又特殊的自然综合体,长江口及其邻近海域是我国重要的陆架海区,一向以生产力高而著称。河口作为淡水与海洋咸水相交并不断混合的特殊水体环境,对环境因子变化的反应与河流和海洋均有差异。本文研究的样品选用2006年6月“东方红2号”科学考察船对长江口及临近海域采集的未受扰动的沉积物样品,北纬31°N至32°N,东经122°E至124°E水域的水平方向的（S7,S8,S9,S10）4个站位。本文采用16S rRNA基因文库分析的方法对长江口及其邻近海域沉积物样品进行细菌群落结构的研究。16S rDNA序列系统进化分析发现细菌主要归属于17个细菌门类:变形菌门（Proteobacteria）（α-、β-、γ-、δ-和ε-亚群）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）、厚壁菌门（Firmicutes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（绿色非硫细菌）（Chloroflexi）、硝化螺旋菌门（Nitrospira）、梭杆菌门（Fusobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、螺旋体门（Spirochete）及待定的门类OP11、SW3、NKB19、OP3和GN09。研究表明变形菌门细菌是一类在海洋中非常常见的细菌,在我们的文库当中发现了变形菌门的5个亚群,包括α-、β-、γ-、δ-、ε-变形菌亚群。所获的16S rDNA基因的序列与GenBank中已知的细菌16S rDNA序列差异较大,这一结果表明在长江口及临近海域沉积物中存在很高的微生物多样性,并潜藏着特有的微生物资源。第二部分一株深海嗜低温萘降解细菌Nah-1 （Cycloclasticus sp.）的分离及降解基因研究多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons,简称PAHs）是指分子中含有两个或两个以上苯环的烃类,是海洋环境中广泛分布的一类污染物,PAHs在环境中积累对人类健康和生态环境都具有巨大的潜在危害,因此越来越受到各国环境科学家的重视[1,3]。目前,微生物对多环芳烃等污染物质的生物降解是海洋环境污染研究中最活跃的领域之一（陈双雅,et al.,2002）本文研究的样品于2005年5月采自南冲绳海槽MD05-2907站位（24°47.19’N,122°29.30’E,水深1245 m）,深海沉积物由法国极地研究所海洋调查船R/V Marion Dufresne号上的CASQ箱式采泥器获得。该研究以萘为唯一碳源和能源从南冲绳海槽沉积物中分离到了一株能降解萘的深海嗜低温细菌,初步研究了该菌的分类、最适生长条件及萘降解的分子遗传机理,为多环芳烃深海微生物降解的深入研究和开发利用提供了菌种资源。实验结果如下:1.形态学观察,生理生化实验,革兰氏阴性,扫描电镜观察细菌形态菌体呈杆状。2.测定了该菌的最适生长条件及生长曲线,生长条件实验表明Nah-1生长的最适条件是萘初始浓度为500㎎/L,16℃、盐度为30,培养72h后萘降解完全。3.16S rRNA基因（16S rDNA）序列同源性分析表明该菌属于γ-变形菌纲的解环菌属,最相似菌株是Cycloclasticus spirillensus P1（GenBanK注册号:DQ659429）,相似度99%。与Nah-1相似度比较高的菌株都属于解环菌属（Cycloclasticus）。4.PCR扩增萘降解基因得到目标片段,比对结果表明,相似度最高的基因phnA1来自Cycloclasticus sp. A5,为99%,该基因编码的蛋白是萘双加氧酶大亚基。其他相似的基因是Cycloclasticus sp. P-1P32 （nahAc）等。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 长江口及其邻近海域沉积环境细菌多样性研究
• 前言
• 1 长江口及其邻近海域生态与环境状况
• 1.1 长江口及其邻近海域环境特点
• 1.1.1 水文特点
• 1.1.2 水化学特征
• 1.1.3 沉积环境特点
• 1.2 分子生态学方法广泛应用于微生物研究
• 1.2.1 限制性片段长度多态性分析
• 1.2.2 末端限制性片段长度多态性分析
• 1.2.3 克隆文库分析法
• 1.2.4 变性梯度凝胶电泳（DGGE）或者温度梯度凝胶电泳（TGGE）
• 1.2.5 单链构象多态性方法
• 1.3 以 PCR 为基础的分子生态学方法普遍存在的潜在问题
• 1.3.1 样品总 DNA 的提取效率
• 1.3.2 PCR 产生的偏差
• 1.4 16SrRNA 序列分析技术作为微生物分类鉴定的理论依据
• 1.5 本文的研究目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 基本方法
• 2.2.1 样品基因组DNA 的提取
• 2.2.2 16S rRNA 基因文库构建及序列分析
• 2.2.2.1 感受态细胞的制备
• 2.2.2.2 细菌 16S rRNA 基因片断的扩增
• 2.2.2.3 PCR 产物的纯化与连接
• 2.2.2.4 重组载体的转化
• 2.2.2.5 扩增的 16S rRNA 基因基因的限制性酶切分析
• 2.2.2.6 16S rRNA 基因测序及系统进化分析
• 2.2.2.7 多样性覆盖率、多样性指数和稀释曲线分析
• 3 结果与分析
• 3.1 PCR扩增产物的限制性酶切分析（ARDRA）
• 3.2 16S rRNA 基因序列系统进化分析
• 3.2.1 变形菌门（Proteobcteria phylum）序列分析
• 3.2.2 绿弯菌门（Chloroflexi phylum）序列分析
• 3.2.3 浮霉菌门（Planctomycetes phylum）序列分析
• 3.2.4 酸杆菌门（Acidobacteria phylum）序列分析
• 3.2.5 放线菌门（Actinobacteria phylum）序列分析
• 3.2.6 拟杆菌门 （Bacteroidetes phylum）序列分析
• 3.2.7 其它门类序列分析
• 4 讨论
• 第二部分 一株深海嗜低温萘降解细菌Nah-1 （Cycloclasticus sp.）的分离及降解基因研究
• 前言
• 1 深海及其环境特点
• 1.1 深海环境特点
• 1.2 海洋微生物的生物多样性
• 1.3 深海微生物的开发利用
• 1.4 PAHs及对海洋环境污染的概况
• 1.4.1 PAHs 及其危害
• 1.4.2 海洋PAHs 污染的来源
• 1.4.3 PAHs 污染的生物修复（Bioremediation）
• 1.5 降解PAHs 的微生物
• 1.6 PAHs 微生物降解的一般途径
• 1.7 PAHs 降解菌及降解基因研究进展
• 1.7.1 解环菌（Cycloclasticus）的研究进展
• 1.7.2 海洋微生物对萘的生物降解
• 1.8 本文的研究目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 ONR7a 培养基
• 2.3 主要实验仪器
• 2.4 基本方法
• 2.4.1 萘降解细菌的分离及形态观察
• 2.4.2 生长条件及生长曲线测定
• 2.4.3 16S rDNA 片断的扩增
• 2.4.4 萘降解基因的 PCR 检测
• 3 结果与分析
• 3.1 萘降解菌株的分离及形态观察
• 3.2 底物浓度对菌株生长的影响
• 3.3 盐度对菌株生长的影响
• 3.4 温度对菌株生长的影响
• 3.5 生长曲线
• 3.6 16S rDNA 系统发育分析
• 3.7 萘降解基因的检测
• 4 讨论和结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文