周波林1周志敏2（1广西北海市人民医院药剂科536000；2广西食品药品检验所530021）
【摘要】目的建立以反相高效液相色谱法测定人血浆中血药浓度地西泮的方法。方法采用DiamonsilC18(250nm×4.6nm，5μm)色谱柱，流动相为甲醇：水(65:35)，流速为1.0ml/min，检测波长为254nm，柱温为25℃，采用蛋白沉淀法处理血浆样品。结果地西泮血浆浓度在5.15～25.75μg(r=0.9991)范围内线形关系良好，低、中、高三种浓度的平均相对回收率分别为103.01％、101.87％，99.09％，RSD均小于4％。结论本方法简便、快速、准确、灵敏度高，可用于地西泮血药浓度测定和人体药动学研究。
【关键词】地西泮反相高效液相色谱法血药浓度
地西泮(diazepam)是临床上常用的镇静、催眠、抗惊厥药，在体内主要经肝脏细胞色素P450酶作用进行氧化代谢，具有遗传多态性和东、西方人种之问的差异，作为临床常用的镇静催眠药也可用于抗焦虑、抗癫痫治疗，大剂量可引起外周神经肌肉阻断、兴奋不安等不良反应，严重的可导致死亡。这药物不但临床应用广泛，而且也是急诊药物中毒和自杀患者的常服药物，此类药物在中毒药物中居首位[1]，因此监测其血药浓度对临床治疗和中毒抢救均有重要意义。本试验拟建立简便、快速、准确的反相高效液相色谱法测定的地西泮血药浓度，为临床治疗和中毒抢救提供理论依据。
该药物的定性定、量方法，国内外文献有不同的报道，本文结合文献资料和实验筛选建立了相应的提取方法和色谱条件，结果方法简便、快速、重现性好，适合于临床血药浓度监测和药动学研究。
1.仪器与试药
1.1仪器
日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪；ShimadzuLCSolution色谱工作站。CPA225D电子分析天平；TGl6G型台式高速离心机；WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；艾科浦超纯水系统(Aquapro公司)；
1.2试药
安定化学对照品(中国药品生物制品检定所提供)；水为超纯水；甲醇(色谱纯)；乙酸铵(分析纯，北京化工厂)；
2.1溶液的制备
2.1.1安定标准贮备液精密称取于105℃干燥至恒重安定对照品10.30mg置10ml棕色量瓶中，甲醇溶解后并定容至刻度，配得1．030mg/ml标准贮备液，密封置于4℃冰箱保存。
2.1.2安定系列标准溶液分别精密吸取该储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，分别置于10ml容量瓶中，加入氯仿定容，制成浓度51.50、103.00、156.50、206.00、257.50μg.ml-1的系列工作液，
2.2色谱条件
色谱柱DiamonsilC18(250nm×4.6nm，5μm)；流动相为甲醇：水(65:35)，流速为1.0ml/min，检测波长为254nm，柱温为25℃,进样体积：20μl；吡嗪酰胺的保留时间约为5.6min，色谱图见图1。血浆中安定峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰。
2.3血浆样品处理
取血浆100μL于具塞离心管中，加入甲醇350μL，涡旋振荡2min，3000r/min离心10min，取上清液即得。
2.4标准曲线制备
取空白血浆90μl，加安定标准系列溶液10μl，配制成5.150、10.30、15.45、20.60、μg.ml-1的血浆样本，按“2．3”项下操作，并按“2.2”项下条件进行色谱分析；以血浆标准溶液浓度x为横坐标．峰面积y为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：Y=14108.60X+12719.83(r=0.9998，n=5),表明安定在5.15～25.75μg.ml-1浓度范围内,与峰面积有良好线性关系。
2.5相对回收率试验
配制低、中、高3个浓度(5.15，15.45，25.75μg.ml-1)的标准血浆各5份，按“2．3”项下操作，并按“2.2”项下条件进行色谱分析，记录峰面积，计算3个浓度的回收率。结果见表1。
表1回收率试验（n=5）
2.6绝对回收率试验
配制低、中、高3个浓度(5.15，15.45，25.75μg.ml-1。)的标准血浆各5份，按“2.3”项下操作，并按“2.2”项下条件进行色谱分析，记录峰面积，与流动相配制的相同浓度对照品溶液所测峰面积相比较，计算3个浓度的绝对回收率。结果见表2。
表2绝对回收率试验（n=5）
2.7精密度试验
取地西泮血浆样本(20.40μg?mg-1)，按“2．3”项下操作，并按“2.2”项下条件进行色谱分析，重复测定地西泮的峰面积，RSD为2.96％，n＝5。
2.8稳定性试验
取地西泮血浆样本(25.75μg?mg-1)分别于配制后室温放置0，2，4，6，8，12h后，按“2．3”项下操作，并按“2.2”项下条件进行色谱分析，测定地西泮的峰面积，RSD为2.92％。
2.9重复性试验
取地西泮血浆样本样品5份（5.15～25.75μg?ml-1），按“2.3”项下操作，并按“2.2”项下条件进行色谱分析，测定地西泮的峰面积，计算含量，RSD为3.08％。
3.讨论
高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography\HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部位。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、与柱或保护住、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。
本实验在选定色谱条件时，参照文献资料[2]，选甲醇、水为流动相，并对两者进行了不同配比及流速(分别为0.8、0.9、1.0、1.1，1.2ml／min)试验。结果表明，在甲醇和水的比例65:35，流速为1.0ml/min，保留时间为min时，对照品及供试,溶液的峰型对称性好、无干扰；理论板数均超过所要求的1500，且当流速为1.0ml／min时，理论板数最大，精密度最好。在选定波长时，对所检测的溶液在200～400nm范围内进行光谱扫描，得检测波长为254nm，在此测定波长下，地西泮回收率测定、精密度、重复性试验、稳定性试验和线性关系考察，都能获得满意的结果，且无其他干扰峰。本文建立的方法不仅能对中毒药物提供定量的依据，也可用于临床的血药浓度监测。
参考文献
[1]李焕德，阎小华，聂星湖，等．血药浓度监测在抢救药物中毒患者中的临床意义与应用[J].中国急救医学，1992，12(5)：1-3
[2]李螈，袁汀，段旭，等.高效液相色谱法测定地西泮中毒患者血浆与尿中地西泮浓度[J].医药导报，2007，26（12）：1415-1417.