抗猪圆环病毒2型卵黄抗体的研制及效果的研究

论文摘要

本研究制备了抗猪圆环病毒2型特异性卵黄抗体,研究了抗体体外和小鼠体内抑制病毒增殖的能力。主要研究内容如下：1.抗猪圆环病毒2型特异性卵黄抗体的制备选取32只22周龄健康产蛋鸡,随机分为4组,每组8只,每只为一个重复。对照组注射生理盐水,试验组1：用灭活的PCV2与弗氏佐剂乳化后逐次增加剂量免疫蛋鸡；试验组2：用灭活的PCV2与弗氏佐剂乳化后保持相同剂量免疫蛋鸡；试验组3：用PCV2免疫蛋鸡；共免疫五次。用ELISA和胶体金两种方法检测蛋鸡血清抗体和卵黄抗体水平,水稀释-硫酸铵一次盐析-二次盐析-透析-浓缩提取IgY, BCA法检测每一次提取后所获得的蛋白浓度,SDS-PAGE检测各步骤提取后IgY纯度。结果表明：各试验组蛋鸡的血清抗体水平始终高于卵黄抗体水平,试验组1所获得的抗体效价最高,最高效价可达到1：640,并且持续时间较长,持续时间可达8周以上；通过水稀释-硫酸铵一次盐析-二次盐析-透析-浓缩各步骤提取,每10 ml卵黄液最终可获得卵黄抗体51.67 mg；经SDS-PAGE检测,杂带较少,抗体纯度较高o2.抗猪圆环病毒卵黄抗体的体内外中和试验IgY的最大无毒作用浓度的研究：在96孔细胞培养板中,将卵黄抗体倍比稀释成不同浓度,加入长成良好的细胞,用倒置显微镜观察细胞病变情况；IgY体外中和试验：将卵黄抗体倍比稀释成不同浓度,与200 TCID50的PCV2体外中和1 h后加入长成良好的细胞,培养48 h后收集细胞,提取病毒DNA,通过实时荧光定量PCR测定病毒的拷贝数；IgY体内中和试验：选取30只8周龄SPF级BALB/c小鼠,分为3组,阴性对照组：腹腔注射生理盐水,0.5 ml/只；试验组：IgY与PCV2（107TCID50/ml）中和一个小时后腹腔注射,0.5 ml/只；阳性对照组：腹腔注射PCV2（107TCID50/ml）,0.5 ml/只,于7 d、14 d采集血液和组织,检测小鼠体内病毒复制情况和血清抗体水平。IgY细胞毒性试验结果表明：IgY不引起细胞产生CPE,但会促进细胞的生长,产生细胞堆积,并且随着IgY浓度的降低,堆积现象逐渐减少,当IgY浓度为0.9 mg/ml时,堆积现象消失；IgY体外中和试验表明：当IgY的浓度为225μg/ml时,阳性对照组和试验组细胞中PCV2的拷贝数存在显著差异,处理组IgY抑制了病毒的复制,并且随着IgY浓度的增加,病毒的拷贝数逐渐降低；IgY体内中和试验结果表明：当IgY浓度为100 mg/ml时,IgY能够明显抑制小鼠组织中PCV2的增殖。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 文献综述
• 1 圆环病毒的研究进展
• 1.1 病毒的理化性质
• 1.2 病毒的分类
• 1.3 PCV2相关疾病
• 1.3.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）
• 1.3.2 猪皮炎与肾炎综合征（PDNS）
• 1.3.3 PCV2相关繁殖障碍
• 1.3.4 猪呼吸道疾病综合症（PRDC）
• 1.3.5 增生性肠炎
• 1.4 PCV2的诊断技术
• 1.4.1 PCV2抗体的检测技术
• 1.4.2 PCV2抗原的检测技术
• 1.4.3 PCV2的基因组检测
• 1.5 PCV2相关疾病的防制
• 1.5.1 防止混合感染
• 1.5.2 加强饲养管理
• 1.5.3 加强免疫
• 1.6 PCV2感染动物模型的建立
• 1.6.1 PCV2单独感染动物模型的建立
• 1.6.2 PCV2混合感染动物模型的建立
• 1.6.3 PCV2感染小鼠模型的建立
• 2 IgY的研究进展
• 2.1 IgY的形成
• 2.2 IgY的特点
• 2.2.1 IgY的结构及功能特性
• 2.2.2 卵黄抗体的稳定性
• 2.3 IgY的制备技术
• 2.3.1 IgY产生的免疫影响因素
• 2.3.2 IgY的制备
• 2.4 IgY在兽医、人类和免疫诊段学方面的应用
• 2.4.1 IgY在兽医方面的应用
• 2.4.2 卵黄抗体用于预防和治疗人类疾病的应用
• 2.4.3 IgY及免疫诊断学
• 3 本研究的目的、意义和主要内容
• 第一章 抗猪圆环病毒2型特异性卵黄抗体的制备及分离纯化
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 主要试剂
• 2.3 试剂配制
• 2.3.1 饱和硫酸铵溶液
• 2.3.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂配制
• 2.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂配制
• 2.4 试验动物及分组
• 3 试验方法
• 3.1 免疫原制备
• 3.2 蛋鸡的免疫
• 3.3 样品的采集
• 3.4 IgY的分离、提取、纯化
• 3.5 抗体效价的检测
• 3.6 抗原最佳包被浓度的确定
• 3.7 ELISA检测方法
• 3.8 各提取步骤卵黄抗体蛋白含量测定
• 3.9 SDS-PAGE检测IgY纯度
• 4 结果与分析
• 4.1 血清抗体方阵滴定结果
• 4.2 卵黄抗体方阵滴定结果
• 4.3 不同免疫方式对鸡血清抗体水平变化的影响
• 4.4 不同免疫方法对鸡卵黄抗体变化的影响
• 4.5 胶体金法检测血清抗体效价
• 4.6 胶体金法检测卵黄抗体效价
• 4.7 卵黄抗体纯度
• 5 讨论
• 5.1 不同免疫方法对抗体水平的影响
• 5.2 卵黄抗体的分离、提取、纯化
• 6 小结
• 第二章 猪圆环病毒2型卵黄抗体的体外中和试验
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验仪器
• 2.3 试验试剂
• 2.4 试验试剂的配制
• 2.5 试验动物
• 2.6 试验方法
• 2.6.1 卵黄抗体对细胞毒性的测定
• 2.6.2 病毒感染滴度的测定
• 2.6.3 抗猪圆环病毒2型卵黄抗体细胞体外中和试验
• 2.6.4 抗猪圆环病毒2型卵黄抗体小鼠体内中和试验
• 2.7 结果与分析
• 2.7.1 卵黄抗体对细胞的毒性试验
• 2.7.2 抗猪圆环病毒2型卵黄抗体体外中和试验
• 2.7.3 抗猪圆环病毒2型卵黄抗体小鼠体内中和试验
• 2.8 讨论
• 2.9 小结
• 参考文献
• 致谢