乙型肝炎病毒L纳米颗粒作为一种新型载体用于肝癌靶向性基因与药物治疗

论文摘要

第一部分乙型肝炎病毒L颗粒的真核表达和纯化鉴定目的利用一种基因工程质粒pSVsigLMS表达和纯化乙肝病毒L颗粒,并鉴定其理化性质和抗原性。方法重组质粒pSVsigLMS采用DEAE-葡聚糖法瞬时转染COS7细胞,培养上清通过澄清、PEG6000浓缩沉淀、Cscl等密度超速离心、蔗糖密度梯度超速离心分离纯化L颗粒。通过SDS-PAGE和Western blotting技术检测纯化蛋白的分子量以及蛋白的抗原性。BCA法和RIA法分别确定总蛋白和L蛋白浓度,并计算纯度。透射电子显微镜（TEM）及原子力显微镜（AFM）观测不同条件下L颗粒的物理形态。结果通过超速离心技术结合ELISA法成功纯化具有S抗原性的蛋白颗粒。SDS-PAGE和Western blotting证实纯化蛋白同时具有PreSl抗原性,为分子量约42KD的糖基化L蛋白,纯化产物中L蛋白纯度>90%。透视电镜显示L蛋白能自组装成直径约23nm的球形颗粒,AFM显示在液态环境中L颗粒的平均直径约180nnm,高浓度下能聚集成直径约8μm的树枝状结构。结论通过在L编码基因的氨基端融合外源性信号肽编码序列,能有效的引导L蛋白穿过内质网膜,L蛋白自组装成颗粒并分泌到培养基质。超速离心技术能有效的纯化L颗粒并保持其生物学活性和物理结构。第二部分乙型肝炎病毒L纳米颗粒用于肝癌靶向性基因治疗转运载体的体外实验目的将外源基因导入乙肝病毒L纳米颗粒,以检测L颗粒用作肝癌靶向性基因治疗转运载体的可行性。方法通过电穿孔方法将荧光表达质粒pGFP导入L颗粒,形成的L/pGFP颗粒转染各种肝来源细胞系及非肝来源细胞系,未经过电穿孔的pGFP与L颗粒的混合物作为对照组同时转染相同细胞系。通过荧光显微镜比较两者的转染效率和特异性。结果电穿孔能有效的将GFP质粒导入L颗粒,在电压=400V,脉冲时间=60μs,pGFP:L颗粒=4:10的条件下,L/pGFP颗粒能得到最大的转染效果。L/pGFP颗粒对各种肝来源细胞系均保持较高的转染效率,对正常肝来源细胞L02的转染效率低于肝癌细胞系HepG2和7721,然而均显著高于脂质体转染效率（P<0.05）。非肝来源的乳腺癌和淋巴瘤细胞系不能被L/pGFP颗粒有效转染。结论电穿孔方法能有效的将外源核酸导入L颗粒而不破坏其物理特性以及与肝细胞的结合能力。携带外源性基因的L颗粒能特异性、高效率转染各种肝来源细胞,可作为一种安全高效的靶向性转运载体用于肝癌的基因治疗。第三部分乙型肝炎病毒L纳米颗粒联合化疗药物阿霉素作为肝癌靶向性给药系统的研究目的化疗药物阿霉素导入乙肝病毒L纳米颗粒,以检测L颗粒用作肝癌靶向性给药系统的可行性。方法通过电穿孔方法将化疗药物阿霉素导入L颗粒,形成的L/阿霉素转染肝癌HepG2细胞系。未经过电穿孔的阿霉素与L颗粒的混合物作为对照组同时转染相同细胞系。通过MTT法、Hoechst染色、荧光分光光度计比较两者对肝癌细胞生长、细胞凋亡的影响以及细胞内药物浓度的变化。结果L/阿霉素能显著抑制HepG2的生长;在化疗药物总量相同的条件下,L/阿霉素处理组细胞凋亡率（44.6±3.5%）明显高于阿霉素组（19.5±2.4%）及阿霉素与L颗粒的混合组（20.4±2.7%）;荧光分光光度计检测表明L/阿霉素处理组胞内化疗药物浓度显著高于阿霉素组（P<0.05）。结论电穿孔方法能有效的将化疗药物阿霉素导入L颗粒,L颗粒与阿霉素混合液经电穿孔后能显著提高阿霉素的胞内药物浓度,抑制肝癌细胞的生长,促进癌细胞发生凋亡。L颗粒可作为一种安全高效的靶向性给药系统用于肝癌的药物治疗。

论文目录

• 中英文缩写对照表
• 前言
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文
• 第一部分 乙型肝炎病毒L颗粒的真核表达和纯化鉴定
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 乙型肝炎病毒L纳米颗粒用于肝癌靶向性基因治疗转运载体的体外实验
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 乙型肝炎病毒L纳米颗粒联合化疗药物阿霉素作为肝癌靶向性给药系统的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 综述一 肝脏靶向性基因治疗的研究进展
• 综述二 Survivin基因与肿瘤的诊断和治疗
• 附录
• 致谢