脊髓孤啡肽在大鼠炎症痛及针刺镇痛中的作用及其机制研究

论文摘要

慢性炎症痛是最常见的病理性疼痛之一，是由多种原因（包括创伤、细菌、病毒感染以及外科手术）导致外周组织受损所引起的持续性的疼痛状态。关于炎症痛产生的外周和中枢机制一直是近年国内外疼痛研究的热点。国内外大量研究表明，许多外周和中枢结构以及多种化学物质参与了炎症痛的形成及调制过程。然而，目前对其确切的发病机制尚未完全明确。孤啡肽（orphanin FQ／nociceptin，N／OFQ）是1995年发现的一级结构与强啡肽A相似的17肽（FGGFTGARKSARKLANQ），分子量为1810，它是阿片受体样受体（opioid receptor-like 1 receptor，ORL1；the nociceptin receptor，NOP）的内源性配体。N／OFQ与μ，δ，κ等经典阿片受体的亲和力很低，也不能使之激活，但与NOP具有很高的亲和力并使之激活。N／OFQ及其受体广泛分布于中枢神经系统，参与痛觉调制、心血管活动、神经内分泌、免疫、利尿、进食、学习记忆等多种生理活动。而在痛觉调制方面，因与经典的内阿片肽明显不同而受到关注。目前认为，脑内N／OFQ致痛敏并对抗吗啡镇痛，脊髓N／OFQ则产生镇痛作用并能加强吗啡镇痛。我室以往研究表明，脊髓N／OFQ通过其受体对神经痛大鼠产生镇痛作用；脊髓N／OFQ系统参与了神经痛的过程。那么，脊髓水平给予孤啡肽对慢性炎症痛有何影响?内源性孤啡肽及其受体在慢性炎症痛发生、维持的不同阶段的表达有何变化?以及它们在慢性炎症痛中发挥什么作用?临床上常用的各类抗炎药、镇痛药，长期使用均会产生不同程度的副作用。而针刺作为一种有效而副作用极少的缓解疼痛的手段，在国内外临床及动物实验中均得到证实。多年来对针刺镇痛的机理研究表明，针刺是通过激活机体内源性痛觉调制系统，如阿片肽系统而起镇痛作用的。那么，作为内阿片肽家族的新成员——N／OFQ在针刺治疗炎症痛时发挥什么作用?因此，阐明N／OFQ在大鼠慢性炎症痛以及针刺镇痛中的作用是本课题研究的主要内容之一。随着疼痛研究的不断深入，目前认为星形胶质细胞在慢性痛中发挥着举足轻重的作用。大量研究表明，病理性痛刺激激活星型胶质细胞后可以释放与中枢敏化形成有关的前炎性细胞因子（如：IL-1β、IL-6、TNF-α等）。此外，据文献报道，NOP除了分布在与痛觉密切相关的区域（如脊髓背角、低位脑干和中脑导水管周围灰质等）的神经元上，还分布在脑内星形胶质细胞上。这就提示N／OFQ系统可能与星形胶质细胞的功能活动存在着密切关系。那么，脊髓星形胶质细胞是否也表达孤啡肽的受体?星形胶质细胞在孤啡肽镇痛中是否发挥作用以及其作用机制又是什么?因此，探讨N／OFQ系统与星形胶质细胞之间的相互关系，初步揭示N／OFQ的作用机制是本课题研究的另一主要内容。综上所述，本课题拟在完全福氏佐剂（complete Freund’s adjuvant，CFA）建立的单侧足底慢性炎症痛大鼠模型上，从行为学到形态学等不同方面，从整体到离体等不同水平，采用RT-PCR、免疫组织化学染色、Western-Blot以及神经细胞培养等技术，（1）明确脊髓N／OFQ系统在炎症痛及针刺镇痛中的作用；（2）观察内源性的N／OFQ及其受体在慢性炎症痛发展的不同阶段以及针刺镇痛中的变化；（3）观察在慢性炎症痛发展的不同阶段，脊髓背角星形胶质细胞功能活动的变化；（4）从星形胶质细胞的视角，初步揭示N／OFQ的作用机制。实验结果如下：1．脊髓N／OFQ-NOP系统在大鼠炎症痛及针刺镇痛中的作用1．1脊髓蛛网膜下腔内注射N／OFQ对炎症痛大鼠痛阈的影响在大鼠后肢足底皮下注射100μl CFA建立炎症痛模型后的第4天，大鼠随机分成4组，分别于鞘内注射1.5，5，15 nmol N／OFQ，生理盐水（NS），在给药前及给药后10，20，30，60，90 min采用辐射热缩腿反射的方法，测定缩腿潜伏期（PWL），以缩腿潜伏期变化的百分比（（处置后PWL-处置前PWL）／处置前PWL，PWLs）为观察指标。结果表明：15 nmol N／OFQ显著提高炎症痛大鼠的痛阈，具有明显的镇痛效应。1．2脊髓蛛网膜下腔内注射N／OFQ受体拮抗剂对炎症痛大鼠痛阈及N／OFQ镇痛作用的影响在炎症痛模型建立后的第4天，鞘内注射15 nmol N／OFQ，5 min后鞘内给予[Nphe1]nociceptin（1-13）NH2（N／OFQ受体拮抗剂）。大鼠随机分成4组，15 nmolN／OFQ，20 nmol[Nphe1]nociceptin（1-13）NH2，15 nmol N／OFQ+20 nmol[Nphe1]nociceptin（1-13）NH2，NS，在给药前及给药后10，20，30，60，90 min测定PWL，以PWLs为观察指标。结果表明：N／OFQ受体拮抗剂对炎症痛大鼠痛阈无明显影响，但能有效阻断N／OFQ对炎症痛大鼠的镇痛作用。1．3单次电针对炎症痛大鼠痛阈的影响在炎症痛模型建立后的第4天，大鼠随机分成3组，炎症痛组（CFA），炎症痛+假电针组（CFA+sham-EA），炎症痛+电针组（CFA+EA）。在EA治疗前及治疗后10，20，30，60，90 min测定PWL，以PWLs为观察指标。结果表明：电针能提高炎症痛大鼠的痛阈，具有显著的即刻镇痛效应。1．4脊髓蛛网膜下腔内注射N／OFQ受体拮抗剂对电针镇痛作用的影响在炎症痛模型建立后的第4天，鞘内注射20 nmol[Nphe1]nociceptin（1-13）NH2，10 min后给予30 min电针治疗。在EA治疗前及治疗后10，20，30，60，90 min测定PWL，以PWLs为观察指标。结果表明，20 nmol[Nphe1]nociceptin（1-13）NH2能部分翻转电针对炎症痛大鼠的镇痛作用。1．5脊髓蛛网膜下腔内注射N／OFQ对电针镇痛作用的影响在炎症痛模型建立后的第4天，鞘内注射15 nmol N／OFQ，同时给予30 min电针治疗。在给药前及给药后10，20，30，60，90 min测定PWL，以PWLs为观察指标。结果表明：15 nmol N／OFQ能加强电针对炎症痛大鼠的镇痛作用。小结：鞘内注射N／OFQ（15 nmol）对炎症痛大鼠具有镇痛作用；N／OFQ受体拮抗剂可以阻断N／OFQ的镇痛作用，提示鞘内注射N／OFQ通过其受体发挥镇痛作用；电针对炎症痛大鼠具有显著的镇痛作用；N／OFQ受体拮抗剂可以部分翻转电针的镇痛作用，并且能被N／OFQ加强，提示电针可能通过脊髓N／OFQ-NOP系统发挥镇痛作用。2．脊髓背角N／OFQ及其受体在大鼠炎症痛发展的不同阶段以及电针治疗炎症痛时的表达变化大鼠随机分成4组：正常组（Normal），炎症痛组（CFA），炎症痛+电针组（CFA+EA），炎症痛+假电针组（CFA+sham-EA）。炎症痛模型建立后以及给予隔日电针治疗后，（1）采用辐射热缩腿反射的方法，观察大鼠炎症痛的进展，以及电针治疗的累加作用；（2）采用RT-PCR、免疫组织化学染色、Western blot等技术检测脊髓背角N／OFQ及其受体表达的变化。2．1多次电针对炎症痛大鼠痛阈的影响炎症痛模型建立后的第1天给予电针治疗，隔日1次，每次30 min，持续2周。采用辐射热缩腿反射的方法，隔日测定PWL，以痛敏分数（Hyperalgesia score，sec，致炎侧与对照侧PWL的差值）为观察指标。结果表明：大鼠后肢皮下注射CFA 24小时之内即出现典型的炎症痛症状，大鼠的热痛敏在2周内均可维持较高水平；随着电针治疗次数的增加，炎症痛大鼠的痛敏分数逐渐提高，说明电针具有明显的镇痛效应。5次电针以后，与对照组（CFA、CFA+sham-EA）相比，有显著性差异。2．2脊髓ppN／OFQ mRNA在大鼠炎症痛发展的不同阶段以及给予电针后的表达变化大鼠炎症痛模型建立后第4、10、14天，即电针治疗2、5、7次，选取大鼠脊髓腰膨大段，采用RT-PCR技术观察在大鼠炎症痛发生、维持的不同阶段以及给予电针后ppN／OFQ mRNA的表达变化。结果显示：从炎症痛模型建立第4天起，与正常组（Normal）相比，炎症痛大鼠致炎侧的脊髓ppN／OFQ mRNA含量明显增加，给予5次电针后其含量进一步增加。而在对侧脊髓中，ppN／OFQ mRNA表达无显著性变化。2．3脊髓背角N／OFQ含量在大鼠炎症痛发展的不同阶段以及给予电针后的表达变化大鼠炎症痛模型建立后第4、10、14天，即电针治疗2、5、7次，取脊髓腰膨大段进行冰冻切片，选取大鼠脊髓背角作为主要观察部位，采用免疫组织化学方法观察在大鼠炎症痛发生、维持的不同阶段以及给予电针后N／OFQ含量的变化。结果显示：N／OFQ免疫反应阳性细胞主要存在于脊髓背角浅层；从炎症痛模型建立第4天起，与正常组（Normal）相比，炎症痛大鼠致炎侧的脊髓背角N／OFQ免疫反应阳性细胞数明显减少；与炎症痛组（CFA）相比，给予5次电针后其免疫反应阳性细胞数明显增加。而在对侧脊髓背角中，N／OFQ免疫反应阳性细胞无显著性变化。2．4脊髓NOP mRNA在大鼠炎症痛发展的不同阶段以及给予电针后的表达变化大鼠炎症痛模型建立后第4、10、14天，即电针治疗2、5、7次，选取大鼠脊髓腰膨大段，采用RT-PCR技术观察在大鼠炎症痛发生、维持的不同阶段以及给予电针后NOP mRNA的表达变化。结果显示：从炎症痛模型建立第4天起，与正常组（Normal）相比，炎症痛大鼠致炎侧的脊髓NOP mRNA含量明显增加，给予5次电针后其含量进一步增加。而在对侧脊髓中，NOP mRNA表达无显著性变化。2．5脊髓NOP蛋白在大鼠炎症痛发展的不同阶段以及给予电针后的表达变化大鼠炎症痛模型建立后第4、10、14天，即电针治疗2、5、7次，选取大鼠脊髓腰膨大段，采用Western blot技术观察在大鼠炎症痛发生、维持的不同阶段以及给予电针后NOP蛋白的表达变化。结果显示：从炎症痛模型建立第4天起，与正常组（Normal）相比，炎症痛大鼠致炎侧的脊髓NOP蛋白表达明显增加，给予5次电针后其表达进一步增加。而在对侧脊髓中，NOP蛋白表达无显著性变化。小结：多次电针对大鼠炎症痛具有显著的累加镇痛效应。正常大鼠脊髓背角有N／OFQ和NOP的表达；炎症痛形成后，ppN／OFQ mRNA、NOP mRNA、NOP蛋白表达均增加，提示脊髓N／OFQ及其受体参与慢性炎症痛发生、维持的不同阶段。此外，炎症痛大鼠脊髓背角N／OFQ免疫阳性细胞数减少，可能是由于炎症痛发展过程中N／OFQ释放增加，但蛋白合成相对不足所致；炎症痛大鼠给予电针治疗后脊髓背角ppN／OFQ mRNA、NOP mRNA、NOP蛋白表达进一步增加，N／OFQ免疫阳性细胞数也有所增加，提示电针促进脊髓N／OFQ及其受体的合成；N／OFQ合成的进一步增加，代偿了炎症痛过程中其大量释放所引起的阳性细胞数减少。以上结果提示，脊髓N／OFQ及其受体参与了炎症痛发生、维持的不同阶段以及电针治疗炎症痛的过程。3．脊髓背角星形胶质细胞的功能活动在大鼠炎症痛发展的不同阶段的变化大鼠随机分成2组：正常组（Normal），炎症痛组（CFA）。采用免疫组织化学染色、Western blot、RT-PCR等技术观察在大鼠炎症痛发展的不同阶段（炎症痛模型建立后第4、10、14天），星形胶质细胞增生肥大的指标——胶质纤维酸性蛋白（GFAP）以及前炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表达的情况。3．1炎症痛发展的不同阶段，脊髓背角星形胶质细胞增生活化的情况大鼠炎症痛模型建立后第4、10、14天，取脊髓腰膨大段进行冰冻切片，选取大鼠脊髓背角作为主要观察部位，采用免疫组织化学染色方法观察在大鼠炎症痛发生、维持的不同阶段，GFAP的表达变化。结果显示：GFAP免疫反应阳性细胞主要存在于脊髓背角浅层；从炎症痛模型建立第4天起，与正常组（Normal）相比，炎症痛大鼠致炎侧的脊髓背角GFAP免疫反应阳性细胞数显著增加。而在对侧脊髓背角中，GFAP免疫反应阳性细胞无显著性变化。Western blot结果显示：从炎症痛模型建立第4天起，与正常组（Normal）相比，炎症痛大鼠致炎侧的脊髓GFAP蛋白表达明显增加。而在对侧脊髓中，GFAP蛋白表达无显著性变化。3．2炎症痛发展的不同阶段，脊髓前炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表达情况大鼠炎症痛模型建立后第4、10、14天，选取大鼠脊髓腰膨大段，采用RT-PCR技术观察在大鼠炎症痛发生、维持的不同阶段前炎性细胞因子mRNA的表达变化。结果显示：从炎症痛模型建立第4天起，与正常组（Normal）相比，炎症痛大鼠致炎侧的脊髓IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA含量均明显增加。而在对侧脊髓中，前炎性细胞因子表达无显著性变化。小结：炎症痛发生、维持的不同阶段GFAP蛋白以及IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达明显增加，表明脊髓背角星形胶质细胞以及前炎性细胞因子在炎症痛发生、维持的过程中发挥着重要作用。4．N／OFQ镇痛机制的初步探讨4．1脊髓蛛网膜下腔内注射N／OFQ对炎症痛大鼠脊髓前炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表达的影响大鼠随机分成4组：正常组（Normal），炎症痛组（CFA），炎症痛+N／OFQ组（CFA+N／OFQ），炎症痛+N／OFQ+N／OFQ受体拮抗剂组（CFA+N／OFQ+[Nphe1]nociceptin（1-13）NH2）。大鼠断头后，迅速选取脊髓腰膨大段，采用RT-PCR技术检测前炎性细胞因子含量。结果显示：炎症痛大鼠脊髓IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA含量明显高于正常大鼠；给予N／OFQ后，与炎症痛组比较，细胞因子含量明显下降，N／OFQ的该效应可以被N／OFQ受体拮抗剂阻断。4．2脊髓星形胶质细胞表达NOP新生鼠脊髓星形胶质细胞体外培养，采用RT-PCR、免疫细胞化学染色、Western blot等技术检测在星型胶质细胞上是否有NOP表达。结果显示：脊髓星形胶质细胞表达NOP。4．3 N／OFQ对脊髓星形胶质细胞激活后所释放的前炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表达的影响新生鼠脊髓星形胶质细胞体外培养，采用RT-PCR方法检测：（1）脂多糖（LPS）作用星形胶质细胞后，前炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表达情况；（2）N／OFQ，[Nphe1]nociceptin（1-13）NH2，N／OFQ+[Nphe1]nociceptin（1-13）NH2分别对IL-1β、IL-6、TNF-α表达的影响。结果显示：（1）离体条件下，LPS作用星形胶质细胞后，IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA含量明显增加，表明星形胶质细胞激活后可以释放前炎性细胞因子；（2）N／OFQ抑制IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA的表达，[Nphe1]nociceptin（1-13）NH2能拮抗N／OFQ的抑制作用，表明N／OFQ通过NOP抑制来源于星形胶质细胞的前炎性细胞因子的表达。小结：炎症痛发展的不同阶段，脊髓背角星形胶质细胞功能活动增强，前炎性细胞因子释放增加，鞘内注射N／OFQ能抑制前炎性细胞因子的释放；星形胶质细胞表达NOP；离体条件下N／OFQ受体拮抗剂能阻断N／OFQ对前炎性细胞因子表达的抑制作用，提示N／OFQ可能通过NOP抑制来源于星形胶质细胞的前炎性细胞因子的表达，从而发挥镇痛作用。综上所述，本工作提示：1．脊髓N／OFQ通过其受体对炎症痛大鼠产生镇痛作用，电针可能通过脊髓N／OFQ-NOP系统发挥其镇痛作用。2．多次电针对炎症痛大鼠具有累加镇痛效应。3．炎症痛发生、维持的不同阶段以及电针镇痛时，脊髓背角内源性N／OFQ及其受体NOP的表达发生变化，提示脊髓N／OFQ-NOP系统参与炎症痛的发展及电针镇痛过程。4．炎症痛发展过程中，脊髓背角星形胶质细胞功能活动增强，前炎性细胞因子表达增加，表明脊髓星形胶质细胞以及前炎性细胞因子在炎症痛发生、维持的不同阶段发挥着重要作用。5．N／OFQ抑制炎症痛大鼠脊髓前炎性细胞因子的释放；N／OFQ通过NOP抑制来源于脊髓星形胶质细胞的前炎性细胞因子的表达，从而发挥镇痛作用。

论文目录

• 英文缩写字表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 1.材料
• 2.方法
• 2.1 炎症痛大鼠模型
• 2.2 测痛方法
• 2.3 电针方法
• 2.4 "假电针"方法
• 2.5 鞘内埋管及注射
• 2.6 组织切片的制备
• 2.7 免疫组织化学法（ABC法）
• 2.8 Western Blot
• 2.9 RT-PCR
• 2.10 脊髓星形胶质细胞的培养及组化鉴定
• 2.11 统计分析
• 2.12 有关溶液的配制
• 结果
• 1.脊髓N/OFQ-NOP系统在大鼠炎症痛及针刺镇痛中的作用
• 1.1 脊髓蛛网膜下腔内注射N/OFQ对炎症痛大鼠痛阈的影响
• 1.2 脊髓蛛网膜下腔内注射N/OFQ受体拮抗剂对炎症痛大鼠痛阈及N/OFQ镇痛作用的影响
• 1.3 单次电针对炎症痛大鼠痛阈的影响
• 1.4 脊髓蛛网膜下腔内注射N/OFQ受体拮抗剂对电针镇痛作用的影响
• 1.5 脊髓蛛网膜下腔内注射N/OFQ对电针镇痛作用的影响
• 2.脊髓背角N/OFQ及其受体在大鼠炎症痛发展的不同阶段以及电针治疗炎症痛时的表达变化
• 2.1 多次电针对炎症痛大鼠痛阈的影响
• 2.2 脊髓ppN/OFQ mRNA在大鼠炎症痛发展的不同阶段以及给予电针后的表达变化
• 2.3 脊髓背角N/OFQ含量在大鼠炎症痛发展的不同阶段以及给予电针后的表达变化
• 2.4 脊髓NOP mRNA在大鼠炎症痛发展的不同阶段以及给予电针后的表达变化
• 2.5 脊髓NOP蛋白在大鼠炎症痛发展的不同阶段以及给予电针后的表达变化
• 3.脊髓背角星形胶质细胞的功能活动在大鼠炎症痛发展的不同阶段的变化
• 3.1 炎症痛发展的不同阶段,脊髓背角星形胶质细胞增生活化的情况
• 3.2 炎症痛发展的不同阶段,脊髓前炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表达情况
• 4.N/OFQ镇痛机制的初步探讨
• 4.1 脊髓蛛网膜下腔内注射N/OFQ对炎症痛大鼠脊髓前炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表达的影响
• 4.2 脊髓星形胶质细胞表达NOP
• 4.3 LPS诱导脊髓星形胶质细胞激活后,前炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表达特征
• 4.4 N/OFQ对脊髓星形胶质细胞激活后所释放的前炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表达的影响
• 讨论
• 一、脊髓N/OFQ-NOP系统与炎症痛
• 二、脊髓N/OFQ-NOP系统与电针镇痛
• 三、N/OFQ作用机制的初步探讨
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述一 脊髓胶质细胞与疼痛调制机制的关系
• 一、研究背景
• 二、胶质细胞的功能概述与激活的检测
• 三、胶质细胞参与痛信息的产生与维持
• 四、胶质细胞参与痛调控的生物学机制
• 五、胶质细胞在治疗临床病理性痛中的应用
• 六、展望
• 综述二 内源性阿片样肽——内吗啡肽的研究进展
• 1 内吗啡肽的结构与分布
• 2 内吗啡肽的受体结合特性
• 3 内吗啡肽的生物学效应