γ-谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶与大蒜绿变的关系

论文摘要

大蒜为百合科葱属多年生草本植物,蒜的鳞茎具有极高的营养价值和药用价值。我国是大蒜的主要生产国,其产量占世界总产量的四分之三。除鲜食外,大蒜还经常加工成蒜泥、蒜汁、脱水蒜片、蒜粉等制品,但在加工过程中常常出现绿变现象,严重的影响了产品的外观质量,成为妨碍大蒜进一步加工的主要问题。因此研究大蒜制品绿变的机理,对有效控制发绿现象,达到规模化生产具有重要意义。本试验以大蒜鳞茎为原料,研究不同贮藏温度下γ-谷氨酰转肽酶和蒜氨酸酶活性及大蒜绿变能力的变化,来探讨酶与大蒜绿变的关系;对γ-谷氨酰转肽酶进行分离纯化并研究其酶学性质;对不同时期大蒜氨基酸组成变化进行了研究;通过一系列的验证试验,验证γ-谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶和氨基酸与大蒜绿变的关系。主要试验结果如下:1、不同贮藏温度下酶活性及大蒜绿变能力变化分析低温贮藏大蒜可以激活蒜氨酸酶,促使大蒜具有绿变能力。在大蒜贮藏过程中,γ-谷氨酰转肽酶活性变化与大蒜绿变程度变化一致,蒜氨酸酶对大蒜的绿变起着重要作用。2、γ-谷氨酰转肽酶分离纯化采用硫酸铵沉淀法、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析、ConA-Sepharose亲和柱层析法纯化出较高纯度的γ-谷氨酰转肽酶,纯化倍数为14.39倍,回收率为19.4%。通过SDS-凝胶电泳分析,大蒜γ-谷氨酰转肽酶分子量为68,000Da,所含两个亚基分别为54,000Da和14,000Da;大蒜γ-谷氨酰转肽酶的含糖量为11.31%。另由β-消除反应的结果推测其糖肽键类型为N-型,其最大吸收波长为275nm。3、γ-谷氨酰转肽酶酶学性质γ-谷氨酰转肽酶动力学研究表明,在最适反应条件下的动力学常数Km和Vmax分别为10.83mmol/L和28.65u/L;γ-谷氨酰转肽酶的酶促反应在30～180min内基本呈线性关系,选择30min作为最佳反应时间;该酶在50℃以下具有较好的稳定性,最适反应温度为42℃;在pH8.0～9.0有较好的酸碱稳定性,最适pH值为8.5;2mmol/L金属盐离子浓度时,Ca2+、Mg2+对γ-谷氨酰转肽酶的活力有一定的促进作用,Al3+、K+、Na+对酶活力影响不大,其他金属离子均表现出不同程度的抑制作用,在钙离子浓度低于10mmol/L范围内,对酶均有激活作用。4、大蒜绿变验证试验通过验证试验表明γ-谷氨酰转肽酶不直接参与大蒜绿色素的生成,而可能是γ-谷氨酰转肽酶参与大蒜体内生理生化反应,提供二级生成物质并累积到一定量,从而使大蒜具有绿变能力,蒜氨酸酶参与大蒜绿变过程,但不是唯一条件;通过体外模拟试验证明氨基酸并未使新蒜变绿。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 大蒜概述
• 1.1.1 大蒜的化学成分
• 1.1.2 大蒜的重要生理功能
• 1.1.3 大蒜的生理休眠期
• 1.2 国内外有关葱属植物组织变色研究进展
• 1.2.1 洋葱泥的红变
• 1.2.2 蒜泥的绿变
• 1.2.3 影响大蒜绿变的因素
• 1.3 γ-谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶与大蒜绿变的关系
• 1.3.1 γ-谷氨酰转肽酶与大蒜绿变的关系
• 1.3.2 蒜氨酸酶与大蒜绿变的关系
• 1.4 γ-谷氨酰转肽酶研究现状
• 1.4.1 γ-谷氨酰转肽酶的酶源
• 1.4.2 γ-谷氨酰转肽酶的酶学性质
• 1.4.3 γ-谷氨酰转肽酶的功能
• 1.5 本课题研究的目的、内容和意义
• 1.5.1 研究目的
• 1.5.2 研究内容
• 1.5.3 课题意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验原料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器设备
• 2.4 试验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 不同贮藏条件下大蒜绿变能力、酶活性及氨基酸的变化
• 3.1.1 不同贮藏温度对大蒜绿变能力的影响
• 3.1.2 不同贮藏温度下蒜氨酸酶和γ-谷氨酰转肽酶的活性变化
• 3.1.3 不同贮藏温度下酶与大蒜绿变的关系
• 3.2 不同时期氨基酸的变化
• 3.2.1 不同时期大蒜中氨基酸含量变化
• 3.2.2 0～4℃冷库贮藏下不同时期大蒜的氨基酸组成变化比较
• 3.2.3 室温贮藏不同时期大蒜的氨基酸组成变化比较
• 3.2.4 大蒜与变绿大蒜的氨基酸组成变化比较
• 3.3 γ-谷氨酰转肽酶的分离纯化和部分酶学性质的研究
• 3.3.1 γ-谷氨酰转肽酶的粗分离
• 3.3.2 γ-谷氨酰转肽酶的纯化
• 3.3.3 γ-谷氨酰转肽酶的纯化效果和分子量测定
• 3.4 γ-谷氨酰转肽酶的部分酶学性质
• 3.4.1 γ-谷氨酰转肽酶的含糖量
• 3.4.2 γ-谷氨酰转肽酶的糖肽键
• 3.4.3 γ-谷氨酰转肽酶的动力学特性
• 3.5 大蒜绿变的验证试验
• 3.5.1 不同pH 值条件下γ-谷氨酰转肽酶与大蒜绿变的关系
• 3.5.2 氨基酸与大蒜绿变的关系
• 3.5.3 羰基化合物与大蒜绿变的关系
• 3.5.4 γ-谷氨酰转肽酶与大蒜绿变的关系
• 3.5.5 不同微波灭酶时间对大蒜绿变的影响
• 3.5.6 蒜氨酸酶、γ-谷氨酰转肽酶与大蒜绿变的关系
• 3.5.7 温度与大蒜绿变的关系
• 3.5.8 氨基酸和柠檬酸对不同浸提溶剂提取的大蒜溶液的影响
• 4 讨论
• 4.1 酶液浓度、底物浓度和反应时间对酶促反应的影响
• 4.2 γ-谷氨酰转肽酶分离纯化的衔接步骤
• 4.3 γ-谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶与大蒜绿变的关系
• 4.4 氨基酸与大蒜绿变的关系
• 4.5 进一步研究的方向
• 4.5.1 γ-谷氨酰转肽酶的高级结构研究
• 4.5.2 大蒜γ-谷氨酰转肽酶的研究
• 4.5.3 氨基酸与大蒜绿变的关系
• 4.5.4 大蒜绿变机理的推断
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录