红霉素基因工程菌发酵调控优化及初步代谢流分析

论文摘要

目前,市场对红霉素衍生物需求连年猛增,带动了红霉素原料药的发酵生产,但是红霉素发酵单位偏低、杂质组分过高和发酵液粘度较高的问题严重影响着国内红霉素的国际市场竞争力。因此,本论文以课题组前期构建的组分优势的基因工程菌S.erythraeaZL1004为研究对象,通过对发酵培养基组成和发酵过程优化成功地提高了红霉素A的产量,降低了发酵液的粘度。首先,从多种速效有机氮源中筛选到工业羽毛蛋白胨是红霉素发酵的较优速效有机氮源。在此基础上,通过优化工业羽毛蛋白胨和黄豆饼粉的比例使红霉素产量提高了1.98%。针对采用工业羽毛蛋白胨出现的红霉素发酵液粘度过高的问题,我们采用提高发酵过程温度的方法降低发酵液黏度。结果表明,当发酵温度控制在35℃时,发酵液放罐粘度降低70.1%。优化后的发酵工艺放大至25吨罐规模时,红霉素效价达11434U/ml。其次,针对提高发酵温度引起的细胞裂解碎片降低红霉素分离提取膜通量的问题,提出了采用黄豆饼粉水解液替代部分黄豆饼粉的策略,结果红霉素发酵液平均粘度降低了近60%,红霉素效价略有下降。进一步通过无机铵盐替换部分黄豆饼粉的实验发现黄豆饼粉中的磷元素是诱发发酵液粘度升高的主要因子。考虑到磷元素会促进菌体生长进而增加粘度,我们设计了高低总磷浓度不同的培养基。结果表明,低磷含量培养基能够有效降低发酵液粘度,在此基础上前期流加无机磷可以增加红霉素的产量。采用该策略使红霉素效价和红霉素A组分达到12077 U/ml和9040 U/ml。胞外氨基酸和有机酸数据表明前体氨基酸利用速率增加和较少有机酸生成是红霉素产量提高的重要原因。最后,针对红霉素基因工程菌在工业生产规模中遇到的补糖量过高的问题,提出了控制发酵培养基消后pH和发酵过程流加低pH液化糖的策略。结果新工艺下的基因工程菌372吨罐工业生产规模上补糖量降低了53%。采用宏观代谢流定量分析方法考察工业生产菌和基因工程菌高低补糖工艺下的代谢流量分布发现,过高的补糖量会导致其中较大比例的糖以C02的形式释放,这部分糖并未参与到红霉素合成途径中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 红霉素概述
• 1.1.1 红霉素市场现状
• 1.2 红霉素合成基因及代谢工程改造
• 1.2.1 红霉素合成相关基因与代谢工程菌种改造
• 1.3 红霉素发酵过程优化
• 1.4 本文立项意义和主要研究内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 实验原料与试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 培养方法
• 2.2.1 50L发酵罐培养方法
• 3发酵罐培养方法'>2.2.2 25M³发酵罐培养方法
• 2.2.3 红霉素发酵过程糖醇油的补加
• 2.3 在线参数检测方法
• 2.4 离线参数检测方法
• 2.4.1 PMV测定方法
• 2.4.2 发酵液粘度（流变速度）测定
• 2.4.3 流变仪粘度测定方法
• 2.4.4 红霉素化学效价测定方法
• 2.4.5 氨基氮含量测定方法
• 2.4.6 总糖、还原糖测定方法
• 2.4.7 溶磷测定方法
• 2.4.8 铵离子浓度测定方法
• 2.4.9 发酵液蛋白酶活力测定
• 2.4.10 发酵液淀粉酶活力测定
• 2.4.11 红霉素组分分析方法
• 2.4.12 胞外氨基酸分析方法
• 2.4.13 胞外有机酸分析方法
• 第3章 红霉素基因工程菌速效氮源优化与25吨罐规模放大
• 3.1 引言
• 3.2 红霉素基因工程菌发酵培养基速效有机氮源的选择
• 3.3 红霉素发酵培养基速效氮源与迟效氮源的浓度优化
• 3.4 调控发酵温度降低红霉素基因工程菌发酵液粘度
• 3.5 优化后发酵培养基及工艺25M3罐放大实验
• 3.6 本章小结
• 第4章 氮源调节降低红霉素基因工程菌发酵液粘度研究
• 4.1 引言
• 4.2 黄豆饼粉水解液替代黄豆饼粉对红霉素发酵的影响
• 4.2.1 酸解法制备黄豆饼粉水解液
• 4.2.2 酶解法制备黄豆饼粉水解液
• 4.2.3 黄豆饼粉酶解液替换黄豆饼粉降低发酵液粘度
• 4.3 无机铵盐对红霉素发酵液粘度和红霉素产量的影响
• 4.4 降低培养基总磷浓度对发酵液粘度和红霉素产量的影响
• 4.5 磷流加策略降低发酵液粘度和提高红霉素效价
• 4.6 本章小结
• 第5章 372吨罐工程菌红霉素补糖工艺优化与代谢流分析
• 5.1 引言
• 5.2 工业规模下新型补糖工艺策略
• 5.3 工业生产规模下新型补糖工艺对重组菌发酵过程的影响
• 5.3.1 工业生产规模下红霉素重组菌和生产菌发酵过程参数比较
• 5.3.2 生产规模下降低重组菌发酵的补糖速率对发酵过程的影响
• 5.4 工业生产菌与基因工程菌代谢差异分析
• 5.4.1 代谢流计算的假设条件
• 5.4.2 宏观代谢流的计算
• 5.4.3 工业生产菌与不同补糖条件下重组菌代谢流分布研究
• 5.4.4 过程补糖速率与OUR的关系研究
• 5.5 本章小结
• 第6章 总结与展望
• 参考文献
• 致谢