拟南芥抗寄生疫霉菌突变体的筛选及其初步分析

论文摘要

卵菌（Oomycetes）包括腐霉菌（Pythium）、霜霉菌（downy mildews）和疫霉菌（Phytophthora）等,多数是世界上毁灭性植物病原菌,在世界范围内每年造成数百亿美元的经济损失。研究卵菌与寄主植物互作的机理,可望为建立卵菌类植物病原菌防治新途径提供理论依据。植物与病原物互作的结果可分为两类:亲和互作和非亲和互作,两者都是植物抗性因子/易感因子与病原物无毒蛋白/毒性因子复杂互作的结果。近年来人们对非亲和互作的认识突飞猛进,大量的无毒基因和抗性基因被鉴别,但相对于非亲和互作,人们对亲和互作的研究比较少。为了解植物-卵菌亲和互作的机理,本研究在已建立了拟南芥（Arabidopsis thaliana）-寄生疫霉菌（Phytophthora parasitica）亲和互作体系的基础上,通过筛选拟南芥的一个包括12000个独立的T-DNA插入的化学诱导激活型突变体库,寻找抗寄生疫霉菌的拟南芥突变体,以期为了解拟南芥-卵菌亲和互作的机制奠定基础。通过寄生疫霉菌游动孢子接菌离体的拟南芥叶片,我们从约12000个独立转化株的37808个T3代植株中,筛选到失活型突变体165株,激活型突变体145株,其中失活型抗病突变体267-31的抗病性表型十分稳定;将267-31 T4代收种子后,用皿内活体接菌的方法验证其抗病性,结果与T4代离体接菌一致;对野生型拟南芥、抗病突变体接种H1111游动孢子后进行细胞学观察发现,接菌2h后在抗病植株上与野生型上游动孢子萌发率没有明显差异,但在抗病突变体上附着胞产生率明显低,菌丝扩展也明显较慢。通过Tail-PCR法和Southern blot法分析表明,267-31抗病突变体上有3个T-DNA插入位点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 寄生疫霉菌
• 1.2.1 寄生疫霉菌的危害
• 1.2.2 寄生疫霉菌的生理特性、寄主范围及致病机理
• 1.3 拟南芥的研究现状
• 1.3.1 拟南芥作为模式植物的生物学特性
• 1.3.2 拟南芥基因功能的研究方法
• 1.3.2.1 验证基因功能方法
• 1.3.2.2 拟南芥突变体的获得
• 1.4 植物-病原菌亲和互作进展
• 1.4.1 病原真菌和病原细菌毒性因子研究进展
• 1.4.2 植物病原卵菌效应因子研究进展
• 1.4.3 植物中亲和互作相关基因的研究进展
• 1.5 本研究的基础
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 抗寄生疫霉菌拟南芥的筛选
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 拟南芥培养方法
• 2.2.2 寄生疫霉菌H1111 游动孢子悬液制备
• 2.2.3 拟南芥叶片接菌量测定
• 2.2.4 突变体筛选方法
• 2.2.4.1 叶片离体接菌
• 2.2.4.2 抗病突变体培养皿内活体接菌验证
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 接菌量测定结果
• 2.3.2 突变体筛选
• 2.3.3 皿内接菌验证结果
• 2.4 讨论
• 第三章 抗病突变体、野生型拟南芥接菌寄生疫霉菌H1111 后的细胞学观察
• 3.1 材料与仪器
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 野生型拟南芥接菌寄生疫霉菌H1111 后观察结果
• 3.3.2 拟南芥抗病突变体接菌寄生疫霉菌H1111 后观察结果
• 3.4 讨论
• 第四章 Tail-PCR 法和 Southern 杂交验证抗病突变体267-31 的 T-DNA 拷贝数
• 4.1 Tail-PCR 法验证抗病突变体的T-DNA 拷贝数
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 抗病突变体基因组 DNA 提取
• 4.1.2.2 Tail-PCR
• 4.1.3 实验结果
• 4.2 Southern 杂交验证抗病突变体的 T-DNA 拷贝数
• 4.2.1 材料与试剂
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 T-DNA 探针模板制备
• 4.2.2.2 抗病突变体基因组DNA 提取（参照4.1.2.1）
• 4.2.2.3 杂交尼龙膜的制备
• 4.2.2.4 预杂交（prehybridization）
• 4.2.2.5 探针标记
• 4.2.2.6 Southern 杂交（hybridization）
• 4.2.2.7 洗膜
• 4.2.2.8 信号收集（压屏）
• 4.2.2.9 信号检测（扫屏）
• 4.2.3 实验结果
• 4.3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介