三七消减文库构建和皂甙合成关键酶基因克隆及表达

论文摘要

三七（Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen）为五加科人参属植物，是云南的道地药材，有“南方人参”之称。达玛烷型四环三萜皂甙是三七的主要活性物质，在血液系统、心脑血管系统、神经系统、免疫系统、物质代谢以及抗炎、抗衰老、抗肿瘤等方面均有较好的活性。三七皂甙含量与三七的生长年限和生长部位有关。根部是重要药用器官，且3年生根的皂甙含量高于1年生根。推测三七皂甙含量的时间性差异很可能和皂甙生物合成相关基因差异表达调控有关。为了解三七达玛烷型皂甙合成的分子机理，必须首先克隆到相关的差异表达基因并进行深入的研究。该研究利用抑制消减杂交技术构建了三七1年生根和3年生根cDNA的正反向抑制减消文库。结果表明：正向消减文库包括2，000个cDNA克隆，反向消减文库包括500个cDNA克隆，2个库的重组率都在95％以上，cDNA片段的长度分布在200～900 bp左右，平均长度约500 bp左右。消减效率检测结果表明：消减杂交将18S rRNA对照基因减弱了32，000倍。以上结果表明：所构建的cDNA文库能够满足下一步实验的要求。对所得到的正反向消减文库进行斑点杂交，分别从文库中挑选插入片段在500 bp左右的质粒200个，与1年生和3年生DIG标记的SSH-探针分别进行杂交，筛选到110个来自只在三七3年生根中表达或表达量增加的基因，80个来自只在三七1年生根中表达或表达量增加的基因。为进一步确定差异表达基因，我们从斑点杂交的阳性克隆中挑选了6个差异基因进行半定量RT—PCR验证，结果表明：在3年生根中发动蛋白鸟苷三磷酸酶效应子，γ-谷氨酰水解酶，多铜氧化酶Ⅰ型家族蛋白，IspG蛋白，还原型辅酶Ⅰ氧化酶家族蛋白基因表达上调，而S腺苷高半胱氨酸水解酶基因表达下调，提示抑制消减杂交筛选到的大多基因如果在3年生根中高表达，则在1年生根中不表达或差异表达。6个差异表达基因同源比对功能分析结果表明：IspG蛋白是皂甙生物合成途径中关键酶，其它5个基因可能与皂甙的合成有直接或间接关系。IspG蛋白生物信息学分析结果表明。IspG蛋白的EST由524个核苷酸组成，编码146个氨基酸残基，分子量为15.636 KDa。有1个与转录子有关的结构域，功能位点有N-豆蔻酰化位点，N-糖基化位点，酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。其同源性在植物中达90％以上，在微生物中达50％。亚细胞定位于细胞质。对91个EST克隆测序和序列组装分析结果表明：有4个重叠群（Contig）和83个单拷贝EST（Singlet），代表了共计87个独立基因（Unigene），其中23个cDNA含有poly A序列，占整个克隆数的26.4％。功能分类结果表明：已知功能的唯一序列共58个，占66.6％，未知功能唯一序列29个，占33.3％。对已知功能基因分类，得到11类，其中大多基因与代谢途径和分泌途径有关。对37个氨基酸序列可通读的EST进行生物信息学分析，其中跨膜结构和信号肽分析结果表明：3个克隆有跨膜结构，8个克隆有信号肽或是信号锚定蛋白。功能位点分析结果表明：大多数基因与胞外分泌，调节细胞凋亡和细胞周期，信号传导有关。功能结构域分析结果表明：除10个克隆没有预测到功能结构域外，其它结构域与信号传导，转录调控，电子传递等有关。亚细胞定位大多数位于细胞质中。鲨烯环氧酶是皂甙生物合成途径过程中的1个重要的限速酶。根据人参鲨烯环氧酶cDNA序列合成引物，我们从三七根中扩增到三七鲨烯环氧酶全长cDNA。该基因开放阅读框含有1，622个核苷酸，编码537个氨基酸残基，其分子量为59.139 KDa，等电点为8.81（GenBank登录号DQ386734）。同源性分析结果表明，三七鲨烯环氧酶与其它生物鲨烯环氧酶均具有不同程度的同源性。与人参鲨烯环氧酶同源性达到98％，进化树的分析为同一祖先。生物信息学分析三七鲨烯环氧酶基因含有FAD功能区，以Rossmann折叠的NAD（P）-结合区，FAD／NAD（P）-结合区，疏水性，跨膜结构，这些结构和基序说明三七鲨烯环氧酶是一个膜蛋白，可从胞质溶胶中分泌出来。三七鲨烯环氧酶中含有WD domain，G-beta repeat保守结构域，人参中却没有该结构域。二者的亚细胞定位于质体中。人参和三七的编码基因中的密码子偏爱性并不强，仅个别密码子存在偏爱性。荧光定量PCR实验结果证明，三七鲨烯环氧酶在三七不同组织中存在差异表达，在根中的表达水平高于茎和叶，而茎又高于叶，3年生根的表达又高于1年生根的表达。这些结果说明，三七鲨烯环氧酶基因的表达可能是组织特异性的。对该基因表达的研究可为阐明皂甙生物合成途径和其药理学活性奠定基础。

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第一章三七根的抑制消减文库构建

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株和载体

2.1.3 培养基及试剂

2.1.4 引物和接头

2.2 方法

2.2.1 总RNA的提取

2.2.2 SMART cDNA的合成

2.2.3 合成的cDNA的RsaⅠ消化

2.2.4 酶切产物的纯化

2.2.5 Driver和Tester cDNA的制备

2.2.6 消减杂交

2.2.7 Nested PCR扩增消减杂交产物

2.2.8 差减效率的检测

2.2.9 三七根抑制消减文库的构建

2.2.9.1 连接

2.2.9.2 E.coli JM109 感受态细胞制备

2.2.9.3 转化

2.2.9.4 三七根抑制消减文库cDNA片段大小检测

2.2.9.5 质粒DNA提取

2.2.10 电泳检测

3 结果

3.1 三七消减文库构建的策略

3.2 RNA的分离纯化

3.3 cDNA的SMART合成和RsaⅠ酶切

3.4 抑制消减杂交PCR

3.5 消减效率的检测

3.6 抑制消减文库的构建

3.7 消减cDNA文库中cDNA片段大小的检测

4 讨论

4.1 高质量和足够量的RNA是构建高质量cDNA文库的前提

4.2 构建三七根cDNA消减文库的重要性

4.3 选择抑制消减杂交作为研究方法的依据

小结

参考文献

第二章三七差异表达基因的分析

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 常用溶液的配制

2.2 斑点杂交筛选

2.2.1 尼龙膜的准备

2.2.2 探针制备

2.2.3 斑点杂交

2.3 差异基因的测序和同源性分析

2.4 RT-PCR分析

2.4.1 RT-PCR反应体系和条件

2.4.2 PCR扩增产物的定量检测

2.4.3 引物的设计

3 结果

3.1 差异表达基因筛选策略

3.2 差异表达基因的斑点杂交

3.3 差异基因的测序和同源性分析

3.4 差异表达基因的RT—PCR分析

3.5 差异表达基因与皂甙合成相关性分析

3.5.1 皂甙合成关键酶基因分析

3.5.2 与皂甙合成相关基因功能分析

3.6 消减文库中部分基因分析

3.6.1 末端尿苷酸转移酶

3.6.2 果胶脂酶

3.6.3 促分泌的过氧化物酶

3.6.4 14-3-3蛋白

3.6.5 二氢硫辛酰胺琥珀酰（基）转移酶

4 讨论

4.1 三七3年生根和1年生根cDNA中存在着差异表达的基因

4.2 差异基因数量和皂甙合成的可能性分析

4.3 三七3年生根成为主要的药用部位的分子生物学分析

小结

参考文献

第三章三七EST序列生物信息学分析

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 相关软件和程序的获取与安装

2.2 EST序列的获取

2.3 序列组装

2.4 信号肽预测

2.5 跨膜区预测

2.6 亚细胞定位

2.7 蛋白质结构功能域的分析

2.8 功能位点分析

3 结果

3.1 生物信息学分析策略

3.2 序列组装

3.3 蛋白质功能的分类

3.4 蛋白质亚细胞定位分析

3.5 信号肽分析

3.6 跨膜结构的分析

3.7 功能结构域的分析

3.8 功能位点的分析

4 讨论

4.1 EST序列组装的重要性

4.2 EST结构的预测有助于新基因功能的分析

4.3 EST结构的预测为基因提供与之相关的辅助信息

小结

参考文献

第四章三七鲨烯环氧酶基因的克隆与表达分析

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料与试剂

2.2 实验方法

2.2.1 三七根、茎、叶总RNA的分离与cDNA合成

2.2.2 扩增三七鲨烯环氧酶基因编码区的引物设计

2.2.3 PCR扩增三七鲨烯环氧酶基因

2.2.4 PCR产物的纯化

2.2.5 DNA连接反应和大肠杆菌的转化

2.2.6 质粒提取

2.2.7 重组质粒的PCR和限制性内切酶酶切鉴定

2.2.8 测序及序列数据分析

2.2.9 荧光定量PCR

3 结果

3.1 三七鲨烯环氧酶基因克隆和时空表达策略

3.2 RNA的提取和cDNA的合成

3.3 三七鲨烯环氧酶cDNA的克隆与鉴定

3.3.1 三七鲨烯环氧酶cDNA的PCR扩增

3.3.2 三七鲨烯环氧酶cDNA克隆及鉴定

3.3.3 三七鲨烯环氧酶cDNA的序列分析

3.4 三七鲨烯环氧酶基因密码子偏爱性分析

3.5 三七鲨烯环氧酶序列同源性分析

3.6 三七鲨烯环氧酶信号肽和疏水性分析

3.7 三七鲨烯环氧酶中重要基序分析

3.8 三七鲨烯环氧酶基因进化树分析

3.9 三七鲨烯环氧酶基因的表达

3.9.1 常规PCR扩增

3.9.2 标准品获取

3.9.3 实时荧光定量PCR的评价和优化

3.9.4 三七鲨烯环氧酶基因的时空表达和转录水平

4 讨论

4.1 三七皂甙合成酶基因与人参的比较

4.2 三七鲨烯环氧酶基因与其它物种比较

4.3 三七鲨烯环氧酶基因时空表达的意义

小结

参考文献

文献综述

摘要

1 三七的生物学特性

1.1 三七名称的考证

1.2 三七植物学特征

2 三七的道地性

2.1 道地药材生物学原理

2.2 三七道地性分析

2.2.1 三七道地性与其地质背景系统（GBS）、土壤理化状况的关系

2.2.2土壤pH

2.2.3 三七药材道地性与土壤微量元素的关系

2.2.4 气象条件对三七药材道地性的影响

3 三七的药理研究进展

3.1 心血管系统

3.1.1 降低心肌耗氧量,改善心肌缺血

3.1.2 抗心律失常

3.1.3 降血脂,防止动脉粥样硬化

3.1.4 降血压

3.1.5 抗血栓、抗血小板聚集

3.1.6 抗休克

3.1.7 影响血液流变学特性

3.1.8 抗氧化作用

3.2 三七在肿瘤防治中的作用

3.3 抗衰老作用

3.4 对神经系统的影响

3.4.1 镇静作用

3.4.2 镇痛作用

3.5 对免疫系统的影响

4 三七化学成分的研究进展

4.1 三七的皂甙

4.1.1 三七的皂甙成分

4.1.2 三七各部位皂甙含量

4.2 氨基酸成分

4.3 黄酮类成分

4.4 糖类成分

4.5 有机酸

4.6 无机成分

5 次生萜类生物合成的代谢途径

5.1 萜类生物合成途径

5.1.1 甲羟戊酸途径

5.1.2.非甲羟戊酸途径

5.2 生物合成的酶

5.2.1 HMGR酶

5.2.2 DXPS酶

5.2.3 DXR酶

5.2.4 烯丙基转移酶

5.2.5 萜类合成酶

6 三七的分子生物学研究进展

展望

在读期间发表或被接收的论文

致谢

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