女贞过氧化物酶分离、纯化及酶学性质研究

论文摘要

过氧化物酶（Peroxidase, POD, EC1.11.1.7）是广泛存在于各种动物、植物和微生物体内的、其结构和作用机理并不完全相同的一类含血红素的氧化酶,一般含有铁或铜等金属离子,具有多种生理功能。论文以女贞（Ligustrum lucidum Ait.）为材料,研究了女贞叶及果实POD的分离纯化,女贞果实POD热稳定性及海藻糖和β-环糊精的影响,以及女贞果实POD部分酶学性质。从女贞果实中分离得到一种POD,纯化过程包括匀浆、硫酸铵-丙酮协同沉淀、Sephadex G-100凝胶柱层析和DEAE-纤维素阴离子交换层析,纯化倍数为48,回收率13.3%,分子量为22 kDa。从女贞叶质外体蛋白中分离得到单一条带的POD,分子量为62 kDa。女贞叶POD粗酶具有较高的热稳定性,60℃下加热60 min,酶活剩余61%。在35℃、40℃、45℃、50℃水浴中加热一小时后,剩余酶活都在90%以上。在80℃下处理5 min,酶活完全丧失,70℃下处理5 min,酶活剩余71%。在分别添加了适宜浓度的海藻糖和β-环糊精后,女贞叶POD粗酶在60℃下热稳定性分别提高了11%和9.8%。女贞叶POD粗酶最适pH为6.0。纯化后的女贞果实POD最适pH为6.5,最适反应温度为40℃;热稳定性降低,70℃加热5 min,酶活仅剩余26%,60℃下处理60 min酶活剩余44%。女贞果实POD对H2O2的Km值为3.85 mmol/L。底物愈创木酚的Km值为6.2 mmol/L。Ala-Asp和Lys-Val两种短肽能明显提高女贞果实POD在60℃下热稳定性。75μmol/L海藻糖也能有效提高该酶热稳定性,β-环糊精对纯化后的POD没有明显作用,PEG-6000对POD活性表现出抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 过氧化物酶
• 1.1.1 植物POD 的类型划分和组织定位
• 1.1.2 POD 分子结构特点
• 1.1.3 POD 的分离、纯化和鉴定
• 1.1.4 酶蛋白基因表达与调控的分子生物学
• 1.1.5 酶的生理功能及与环境胁迫的关系
• 1.1.6 植物过氧化物酶分离纯化方面的研究进展
• 1.2 女贞及女贞子的研究
• 1.2.1 女贞及女贞子活性成分及其利用价值
• 1.2.2 女贞及女贞子的各种利用价值
• 1.3 研究目的及意义
• 第二章 女贞叶POD 提取、分离及添加剂对其活性的影响
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 试剂与仪器
• 2.2.3 主要实验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 几种植物POD 活性比较
• 2.3.2 粗酶提取
• 2.3.3 女贞不同生长时期过氧化物酶变化
• 2.3.4 女贞叶过氧化物酶粗酶热稳定性
• 2.3.5 女贞过氧化物酶粗酶最适pH
• 2.4 讨论
• 第三章 女贞叶POD 的分离纯化
• 3.1 引言
• 3.2 技术路线
• 3.3 材料与方法
• 3.3.1 实验材料
• 3.3.2 试剂与仪器
• 3.3.3 主要实验方法
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 硫酸铵－丙酮协同沉淀
• 3.4.2 Sephadex G-100 柱层析
• 3.4.3 DEAE-纤维素阴离子交换层析
• 3.4.4 纯化倍数与回收率
• 3.5 讨论
• 第四章 女贞果实POD 的分离纯化
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 试剂与仪器
• 4.2.3 主要实验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 硫酸铵-丙酮协同沉淀
• 4.3.2 Sephadex G-100 柱层析
• 4.3.3 DEAE-纤维素阴离子交换层析
• 4.3.4 纯化倍数与回收率
• 4.4 讨论
• 第五章 质外体POD 的分离提取
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 试剂与仪器
• 5.2.3 主要实验方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 Sephadex G-100 凝胶柱层析
• 5.3.2 电泳鉴定
• 5.3.3 酶促反应动力学测定
• 5.3.4 纯化倍数与回收率
• 5.4 讨论
• 第六章 女贞果实POD 酶学性质研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 实验材料
• 6.2.2 试剂与仪器
• 6.2.3 主要实验方法
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 POD 最适pH
• 6.3.2 温度稳定性和最适温度
• 6.3.3 酶促反应动力学测定
• 6.3.4 二肽对POD 热稳定性的影响
• 6.3.5 海藻糖，β-环糊精，PEG-6000 对果实POD 热稳定性的影响
• 6.3.6 无机离子对POD 活性的影响
• 6.4 讨论
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文