ROS在缺血脑保护中的作用研究

论文摘要

缺血缺氧性脑损伤是死亡率和致残率都很高的常见病,如何有效地防治缺血缺氧性脑损伤已成为当今神经科学领域的一个研究热点。活性氧（reactive oxygen species,ROS）是一类化学性质相当活跃的氧的单电子还原产物。有大量的证据表明,ROS在缺血缺氧性脑损伤的发生中扮演着重要的角色。ROS过量产生,不仅能直接使膜脂质、蛋白质及DNA等大分子物质发生氧化损害而破坏细胞膜及其它细胞结构,还能通过抑制线粒体功能等间接的途径激活凋亡信号通路,引起缺血敏感性脑区,如海马CA1区的神经元于缺血后数天发生选择性迟发性神经元死亡（delayed neuronal death,DND）。但最近的研究发现,ROS还可以作为关键的细胞内信号调节因子,参与对抗细胞损伤的存活机制,介导缺血预处理的神经保护作用。而且,过量使用抗氧化剂治疗缺血缺氧性脑损伤也可产生致命的后果。因此,深入研究ROS在脑缺血中的损伤与保护作用机制,具有重要的理论和临床实践意义。线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel,mitoKATP)是一种存在于线粒体内膜上的可调节细胞代谢活动的钾离子通道。近年的研究表明,mitoKATP在神经保护中具有重要作用。激活神经元mitoKATP可使大脑组织对缺血缺氧的耐受性增强。已有研究发现,ROS可作为关键的细胞内信息物质,介导缺血缺氧或长期氧暴露、乙醇等预处理对缺血缺氧脑的保护作用。但它是否参与神经细胞mitoKATP开放对缺血脑的保护作用尚无报道。Genistein是一种广泛存在于多种植物性食品中的化学物质;具有酪氨酸激酶抑制剂、抗氧化剂和植物性雌激素等多种活性。研究表明,genistein可抑制短暂性全脑缺血引起海马CA1区神经元发生DND;能够抑制培养皮质神经元由氧化剂引起的脂质过氧化。但是,它能否抑制在体动物脑缺血再灌注引起的氧化性损害则未见有文献报道。因此,本工作通过观察线粒体ATP敏感性钾通道开放剂二氮嗪以及genistein这二种药物的神经保护作用机制,对ROS在缺血脑保护中的作用和地位进行探讨。一、ROS在线粒体ATP敏感性钾通道开放剂二氮嗪对缺血脑的保护作用中的地位我们采用大鼠海马脑片为实验模型,以电生理学技术细胞外记录海马CA1区的群体锋电位（population spike,PS）和缺血去极化电位（ischemic depolarization,ID）,以分光光度法测定灌流液中乳酸脱氢酶（LDH）的浓度,以荧光分光光度法测定ROS的水平,观察mitoKATP及ROS在缺血脑保护中的作用及其相互关系。实验结果如下:1.电生理学实验部分1.1缺血时诱发电位和直流电位的变化PS稳定30 min后给予脑片缺血处理,可见PS逐渐减小,约于2 min时消失。PS消失后数分钟,直流电位迅速向负向降低约5 mV（此即ID）。此时给予复灌直流电位可逐渐上升到原有水平,PS也逐渐有所恢复,复灌50 min时PS的恢复率为20.4±1.5%。1.2药物处理对海马CA1区缺血去极化电位的影响预先使用药物灌流脑片,在各组均朱见直流电位发生明显变化。但预先给予mitoKATP开放剂diazoxide（DIA,300μmol/L）灌流脑片可延长缺血后ID出现的潜伏期（与对照组相比,P＜0.01）,ID的幅度也显著减小（P＜0.01）。如预先使用mitoKATP阻断剂5-hydroxydecanoic acid（5-HD,200μmol/L）灌流脑片再给予DIA,则DIA的作用减弱。与DIA组相比,缺血后ID的潜伏期明显缩短,其幅度也明显减小（P＜0.01）。预先使用ROS清除剂N-2-mercaptopropionyl glycine（MPG,500μmol/L）灌流脑片再给予DIA,则DIA的作用也被阻断。与DIA组相比,缺血后ID的潜伏期明显缩短,其幅度明显减小（P＜0.01）。但单独使用5-HD或MPG灌流脑片,ID的潜伏期及幅度与对照组相比,未见显著性差异。1.3药物处理对海马CA1区群体锋电位的影响预先使用药物灌流脑片,在各组均未见PS发生明显改变。但预先给予DIA灌流脑片可推迟缺血后PS完全消失的时间（与对照组相比,P＜0.01）,复灌50 min时PS的恢复率也显著增加（P＜0.01）。如预先使用5-HD灌流脑片再给予DIA,则DIA的作用减弱。缺血后PS完全消失的时间及PS的恢复率与DIA组相比,均有显著性差异（P＜0.01）。预先使用MPG灌流脑片再给予DIA,则DIA的作用也被阻断。缺血后PS完全消失的时间及PS的恢复率与DIA组相比,均有显著性差异（P＜0.01）。但单独给予5-HD或MPG灌流脑片,缺血后PS完全消失的时间及复灌50 min时PS的恢复率与对照组相比,未见显著性差异。2.药物处理对缺血时海马乳酸脱氢酶释放量的影响与对照组相比,缺血30 min时DIA组LDH的释放量显著减少（P＜0.01）。5-HD组LDH的释放量与对照组相比无显著性差异。但5-HD+DIA组LDH的释放量显著多于DIA组（P＜0.01）。MPG组LDH的释放量与对照组相比无显著性差异。但MPG+DIA组LDH的释放量显著多于DIA组（P＜0.01）。3.药物处理对海马ROS生成量的影响DIA组DCF的生成量与对照组相比显著增多（P＜0.01）。5-HD组DCF的生成量与对照组相比无显著性差异。但5-HD+DIA组DCF的生成量显著少于DIA组（P＜0.01）。MPG组DCF的生成量与对照组相比无显著性差异。但MPG+DIA组DCF的生成量显著少于DIA组（P＜0.01）。实验结果表明,diazoxide可延长ID的潜伏期,减小ID的幅度,推迟缺血后PS的消失,提高复灌后PS的恢复率,减少缺血后LDH的释放量,对大鼠海马脑片的缺血性损伤具有保护作用:该作用是通过开放mitoKATP及产生ROS而实现的。二、Genistein对大鼠全脑缺血再灌注后海马组织的氧化应激及损伤的影响我们在大鼠短暂性全脑缺血再灌注实验模型上,观察genistein对海马组织的DND,ROS生成及脂质过氧化的影响,旨在探讨大鼠全脑缺血再灌注后genistein对海马CA1区神经元的保护作用与其抗氧化特性的关系。实验结果如下:1.脑缺血再灌注后海马CA1区神经元形态学的变化焦油紫染色显示,于缺血再灌注后1d,缺血组海马CA1区神经元未见明显变化,其神经元密度与假手术组相比无明显差异。脑缺血再灌注后3-7 d,缺血组海马CA1区失去正常结构,细胞摆列散乱,锥体细胞的存活数随缺血再灌注时间的延长而减少,CA1区神经元密度均显著小于假手术组（P＜0.001）。2.Genistein对脑缺血再灌注后海马CA1区神经元形态学的影响于脑缺血再灌注后5 d,DMSO对照组CA1区锥体细胞几乎完全消失,神经元密度显著低于假手术组（P＜0.01）。Genistein组CA1区锥体细胞大部分存活,其神经元密度显著高于DMSO组（P＜0.001）。3.Genistein对脑缺血再灌注后海马CA1区神经元细胞色素c释放量的影响于缺血再灌注后48 h及72 h,DMSO对照组海马CA1区神经元的胞浆细胞色素c含量均显著高于假手术组（P＜0.01）。而Genistein组海马CA1区神经元的胞浆细胞色素c含量在这两个时间点均低于DMSO组（P＜0.01或P＜0.05）。4.Genistein对脑缺血再灌注后海马CA1区神经元凋亡的影响于缺血再灌注后48 h,DMSO对照组海马CA1区神经元的caspase-3活性虽然高于假手术组,但无显著性意义。于缺血再灌注后72 h,CA1区神经元caspase-3的活性显著高于假手术组（P＜0.01）。在该时间点,Genistein组的caspase-3活性低于DMSO组（P＜0.01）。TUNEL染色显示,于缺血再灌注后第5d,DMSO对照组海马CA1区中,大部分形态学出现损害的神经元均为TUNEL阳性细胞。而假手术组海马CA1区几乎未见TUNEL阳性细胞。Genistein组的TUNEL阳性细胞数,与DMSO组相比,显著减少（P＜0.01）。5.Genistein对脑缺血再灌注后海马组织ROS生成量的影响于缺血再灌注后4 h,从DMSO对照组海马分离的线粒体的ROS生成量显著高于假手术组（P＜0.01）。于缺血再灌注后24 h,其ROS生成量与假手术组无显著差异。而于缺血再灌注后48 h,DMSO组的ROS生成量则明显高于假手术组（P＜0.01）。而Genistein组的海马线粒体ROS生成量在再灌注后4及48 h这两个时间点均显著低于DMSO组（P＜0.05或P＜0.01）。6.Genistein对脑缺血再灌注后海马组织脂质过氧化的影响于缺血再灌注后4 h,DMSO对照组海马组织的丙二醛浓度显著高于假手术组（P＜0.01）。于缺血再灌注后24 h,其丙二醛浓度虽高于假手术组,但无显著性意义。而于缺血再灌注后48 h,DMSO组的丙二醛浓度则明显高于假手术组（P＜0.01）。Genistein组海马组织的丙二醛浓度于缺血再灌注后4 h及48 h这两个时间点均显著低于DMSO组（P＜0.01）。这些结果表明,短暂性全脑缺血再灌注可引起海马CA1区神经元发生选择性DND;genistein对全脑缺血再灌注引起的海马神经元损害具有保护作用,该作用是通过减弱氧化应激、抑制脂质过氧化和抑制线粒体介导的凋亡信号通路实现的。结论1.DIA对大鼠海马脑片的缺血性损伤具有保护作用,该作用可为mitoKATP阻断剂和ROS清除剂所抑制。而且,DIA可使ROS的生成量增多,该作用也可为mitoKATP阻断剂和ROS清除剂所抑制。表明DIA对大鼠海马脑片的缺血性损害具有保护作用,该作用与mitoKATP开放有关,是通过ROS介导而实现的。2.Genistein对全脑缺血再灌注引起的海马CA1区神经元迟发性损害具有保护作用。Genistein可减少脑缺血再灌注过程中海马组织ROS的生成量及丙二醛的水平,减少或降低脑缺血再灌注后海马CA1区神经元胞浆内细胞色素C的水平、easpase-3蛋白的活性及TUNEL阳性细胞数,提示genistein的神经保护作用与抑制脑缺血再灌注过程中ROS生成过多引起的氧化应激和脂质过氧化有关,是通过抑制线粒体介导的凋亡途径实现的。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 ROS在线粒体ATP敏感性钾通道开放剂二氮嗪对缺血脑的保护作用中的地位
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 Genistein对大鼠全脑缺血再灌注后海马组织的氧化应激及其损伤的影响
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 小结
• 参考文献
• 总结
• 文献综述一
• 文献综述二
• 在读期间发表的论文
• 致谢