玉郎伞多糖抗肿瘤作用及其机制的研究

论文摘要

玉郎伞多糖（Yu Lang San polysaccharides,YLSPS）系从蝶形花科植物疏叶崖豆（Millettia pulchra Kurz var-laxior（Dunn）Z.Wei）的块根中提取的多糖组份,可溶于水。本课题组前期大量研究表明,YLSPS对超氧阴离子自由基(O2·-)具有明显的抑制和清除作用,对四氯化碳（CCl4）和过氧化氢（H2O2）诱导的原代肝细胞损伤均具有保护作用,表明其具有较强的抗自由基活性。YLSPS的抗肿瘤活性目前未见国内外相关文献报道,我们采用体内、外相结合的方法,分别从整体、细胞、分子水平上,研究了YLSPS的抗肿瘤作用及其作用机制。目的:1.通过肿瘤细胞体外实验考察YLSPS体外抗肿瘤作用并探讨其分子机制。2.通过荷瘤动物体内实验,考察YLSPS体内抗肿瘤及免疫活性,并初步探讨其作用机制。3.从细胞、分子水平研究YLSPS抗肿瘤作用的免疫学机制。方法:1.应用MTT法研究YLSPS体外对人肝癌细胞株Bel-7404、HepG-2、人胃癌细胞株SGC-7901、人卵巢癌细胞株A2780细胞生长的影响。2.应用Hoechst荧光染色法及Annexin V-FITC/PI双染法等方法研究YLSPS含药血清对人肝癌细胞株Bel-7404细胞凋亡及细胞周期的影响。3.考察YLSPS对小鼠肉瘤S180的抑瘤率、荷瘤小鼠免疫器官指数、外周血白细胞数量的影响,应用免疫组化法研究肿瘤组织中Bcl-2,Bax,p53的蛋白表达;透射电镜观察肿瘤细胞超微结构。从整体动物水平考察YLSPS的体内抗肿瘤活性。4.通过MTT试验、ELISA方法、RT-PCR等实验方法检测YLSPS对淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞及细胞因子的影响,探讨YLSPS对荷S180小鼠及BALB/c小鼠的免疫增强作用的分子机制。结果:1.YLSPS在5～320 mg/L的浓度范围内对人肿瘤细胞株Bel-7404、HepG-2、SGC-7901、A2780均有不同程度的增殖抑制作用,但生长抑制率均＜30%。YLSPS含药血清对人肿瘤细胞株Bel-7404、HepG-2、SGC-7901、A2780均表现明显的细胞毒作用并呈剂量依赖关系,其中对Bel-7404细胞株的增殖抑制最明显,抑制率在15.8%～43.3%之间。2.YLSPS各剂量组（0.75 g/kg、1.50 g/kg、3.00 g/kg）含药血清对细胞周期的影响表现为G2/M期阻滞,作用Bel-7404 12 h后的凋亡指数分别为7.69%±0.50%、9.94%±0.62%、10.76%±0.74%,明显高于NS对照组（4.60%±0.66%）,提示YLSPS含药血清抑制肿瘤细胞增殖可能与细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡有关。3.YLSPS各剂量组（0.15、0.3、0.6 g/kg,ig,d1～d11）治疗小鼠S180实体瘤的平均抑瘤率分别为39.7%、41.3%、52.6%;可提高S180小鼠的脾脏、胸腺指数,与CTX（10 mg/kg,ip,d1、4、7、10）联合应用,其q值处于0.85～1.25之间,表现为协同作用。可明显升高CTX（20 mg/kg,ip,d1、4、7、10）降低的免疫器官指数和外周血白细胞数,表明YLSPS与烷化剂合用具有减毒增效作用。免疫组织化学方法检测结果显示:模型对照组肿瘤细胞中Bcl-2、Bax和突变p53均有不同程度的表达,与模型对照组比较YLSPS组Bcl-2表达较模型组弱,Bax表达较强,而p53的蛋白表达未见显著差异（p＞0.05）。电镜下可见YLSPS给药高剂量组和CTX组肿瘤细胞核染色质浓缩并边缘化,核碎裂,胞浆空泡化明显,表明YLSPS体内可诱导肿瘤细胞凋亡。4.体外实验表明,YLSPS（50、100、200 mg/L）可增强ConA（5 mg/L）诱导的脾淋巴细胞转化,增强LPS对BALB/c正常小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-a、IL-6的诱导作用及ConA对BALB/c正常小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2的诱导作用,而对LPS（10 mg/L）的诱导转化无增强作用。这些结果说明YLSPS能提高免疫细胞的免疫调节作用,并且作用的靶细胞是T淋巴细胞和巨噬细胞,而对B淋巴细胞没有影响。5.经RT-PCR技术分析,YLSPS体外能促进BALB/c小鼠脾淋巴细胞IFN-γ和IL-2,及腹腔巨噬细胞TNF-a和IL-6的mRNA表达。结论:YLSPS对小鼠S180实体型有明显的抗肿瘤作用;与CTX合用,有增效和减毒作用。根据体内、外的实验结果,YLSPS抗肿瘤作用的机理可能是:①提高免疫细胞的免疫调节作用,并且作用的靶细胞是T淋巴细胞和巨噬细胞,而对B淋巴细胞没有影响。②调控肿瘤相关基因的蛋白表达。③直接抑制肿瘤细胞的生长。④阻滞细胞于G2/M期,诱导肿瘤细胞凋亡。

论文目录

• 英文缩略词表
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 玉郎伞多糖体外抗肿瘤作用的研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 第二部分 玉郎伞多糖体内抗肿瘤作用的研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 第三部分 玉郎伞多糖对小鼠免疫细胞功能的影响
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 附录一: IFN-γ、IL-2、TNF-a、IL-6 mRNA序列
• 附录二: 下N-γ、IL-6基因测序图谱
• 全文总结
• 1 本论文的主要研究成果
• 2 本论文的创新之处
• 综述 中药多糖抗肿瘤活性的研究进展
• 1 多糖抗肿瘤作用的机理
• 2 影响多糖抗肿瘤作用的因素
• 3 应用现状及展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的论文目录