论文摘要
研究背景颅骨缺损是神经外科中的一个常见问题,其形成的原因主要见于烧伤、创伤、肿瘤等。修复骨缺损,重建其生物学特性是神经外科急需解决的重要课题之一。颅骨缺损的修复主要包括修复材料的选择和修复方式的优化。为了避免传统的材料所带来的问题,人们开发了许多种人工骨修复材料。其中,“诱导因子+载体缓释系统”模式已成为骨组织工程学研究的一个热点。一种良好的诱导型人工骨材料应具有以下特性:①良好的生物相容性及生物降解性;②骨传导及与其他活性分子复合共同诱导骨发生;③能负载大量细胞,支持骨细胞生长和分化;④合适的机械强度与可塑形性;⑤原料来源广,生产价格廉,便于消毒保存。纵观国内外骨组织工程材料研究可发现,以下几种天然或人工材料逐渐被大多数研究者认可。例如:骨形态发生蛋白（bone morphogenetie protein,BMP）是一种多功能生长因子,其特征是有较强诱导成骨活性,且无种属特异性;胶原（collagen, COL）是骨基质的主要有机成分,COL与BMP复合可延缓BMP释放,可降低BMP的诱导剂量,令其维持较长的作用;羟基磷灰石（Hydroxyapatite,HA）是一种生物相容性和免疫原性都很理想的骨修复材料,纳米级羟基磷灰石（Nano-sized hydroxyapatite,n-HA）因其晶体尺径与人体骨矿中磷灰石相当,骨修复效果更佳;磷酸钙骨水泥（Calcium Phosphate Cement,CPC）具有可塑型性、吸收性和等温自固化等优良性能。到目前为止,上述各种材料单独使用或复合应用,均因存在塑形性、孔隙率、机械强度等不同问题而至实际成骨效果欠佳。为了找到一种可供临床用来修复骨缺损的组织工程材料,我们经过反复实验对CPC进行改良。合成α-磷酸三钙（α-TCP）体系的CPC作为附加载体（Accessional Delivery,AD）,利用仿生矿化技术将天然骨胶原与无机晶核（HA）自组装构建成纳米级核心载体（Nucleus Delivery,ND）,借助AD与ND的内在联系与特性有机地构建成双载体系统（Double Delivery System,DDS）;以提取天然活性蛋白为诱导核心与DDS进行有机组合,在满足材料强度的前提下在DDS上预制出活性生长通道（Active Growth Channel,AGC）的空间结构。把AD、ND和bBMP复合物制备成bBMP/ND/AD释放系统,用真空负压技术将释放体系有效地填充至AGC预制空间,最终制备出在成份、空间构型和生物活性上与正常人骨极其相似的人造骨主体部分,试图解决现有众多单一载体材料的缺陷。基于这种认识,我们进行了以下方面的工作:（1）活性蛋白异位诱导成骨评估;（2）载体材料的物性评估;（3）诱导型人工骨材料修复兔颅骨缺损实验。一、活性蛋白异位诱导成骨实验目的:检验自制备的牛骨形态发生蛋白（bovine bone morphogenetic proteins,,bBMPs）异位诱导成骨性。方法:取昆明小鼠40只,随机分成2组,将bBMPs材料植入小鼠右大腿后内侧肌袋内,术后2周、3周、4周、8周分别行放射学检查、组织学方法评价骨组织生长情况。结果:术后4周x线片显示材料植入区有小条状密度增高,8周见小块状密度增高。组织学显示2周有大量细胞集聚;3周有较多的骨细胞,有骨基质生成;4周有明显骨样组织形成;8周见明显完整的骨组织形成。而对照组没有上述结果。结论:本研究提取纯化的bBMPs在小鼠肌袋中具有良好得生物相容性和异位诱导成骨能力。二、载体材料的制备与物性评估目的:检测核心载体（ND）、附加载体（AD）以及双载体系统（DDS）的微观结构、机械强度与可塑性等。方法:①湿法制备ND,经X线衍射（XRD）、电子显微镜扫描（SEM）测其粒度与微观形态;②马弗炉煅烧法制备α-磷酸三钙（α-TCP）体系的CPC（AD）,用国产多功能压力测试机检测其机械强度,XRD测其TCP纯度,能谱检测钙磷比,SEM观察微观结构;③DDS检测方法同上。结果:①ND材料:ND的粒度为98纳米（nanometer,nm）,与人骨接近;样品经SEM显示微观结构呈花瓣样,具有HA与胶原的共同特征。②AD材料:材料水化72h时平均承压力5000牛顿/cm3（约170Mpa）,水化7d压力为8800牛顿/cm3;受试者工作曲线（ROC）显示结果呈正态分布;XRD测定其TCP含量为92.7%（标样的TCP含量为94%,Fluka公司产品,编号:50553）;材料水化14d后,原料成份已全部水化成HA,XRD显示材料中未见有害基团,孔隙率为45%,能谱分析其成份中钙磷比为1.52;随着水化时间的延长（24h、72h、7d、14d）,SEM显示该材料的结晶先为针状,最终形成板状,呈低结晶状态。③DDS:三组材料样品分别加入0.25%、0.5%、1%ND后,压力测试显示加入0.25% ND的复合材料压力下降至4200牛顿/cm3左右;动态水化过程XRD测试显示添加0.25%ND,水化产物未见明显异常;材料的孔隙率为55%,钙磷比1.6,SEM显示其微观形态与ND相同。结论:本研究所制备的AD材料,添加ND会造成复合材料承压能力下降,压力下降数值与ND加入量呈正相关。加0.25%ND复合材料的压力下降程度符合本实验研究作为支撑（载体）材料的压力强度。复合材料在保持水化产物的稳定条件下,钙磷比更接近人骨,机械强度下降、孔隙率增加,有利于材料降解,是一种理想的骨缺损修复材料。三、诱导型人工骨材料修复兔颅骨缺损实验目的:观察诱导型人工骨材料在修复兔颅骨缺损中的作用效果。方法:选取健康成年新西兰大白兔51只,随机分成实验材料组（复合材料,M组）、实验对照组（同种异体冻干骨,B组）和空白对照组（N组）;M组材料采用固化成型的圆“纽扣”状样品,预制含释放系统（ND、bBMP）的活性生长空间（AGC）;制备双侧颅顶骨8mm的骨膜与骨缺损模型,分别植入相应材料后固定。术后按2周、4周、8周、12周、16周时程分别取材,进行大体观察、外周血液检验、X线影像检查、荧光双标示踪、组织学与免疫组化观察,比较各组材料修复兔颅骨缺损效果。结果:①大体观察:手术后,各组均有3-4只动物术后头顶缝线处轻度肿胀,在3天内消失;2周时,M组与B组植入材料在缺损表面清晰可见,材料与宿主骨之间有组织长入,N组缺损表面有薄层组织覆盖。4周时,M组表面见薄层组织覆盖,但材料仍可见;从顶骨内面见一侧材料的AGC位置有透明黄色组织微突;8周时, M组表面有外骨痂出现,其它各组少量结缔组织覆盖。12周和16周各组骨缺损表面均有组织交织因而不易分辨。②外周血液检查:手术前与术后1周、2周,M组、B组、N组动物的血LYM%值结果统计分析显示:M组LYM%分别与B组、N组间的差异有统计学意义。而三组动物手术前与取材时的血总蛋白、谷丙转氨酶、尿素氮、碱性磷酸酶、钙离子等结果统计分析显示,各组间以及同组5个时间点之间的差异均没有显著意义。③X线影像观察:术后2周M组材料密度高于周围松质骨,植入材料清浙可见;4周时可见左侧材料上已有骨痂形成,8周时轮廓已分辨不清,材料中央区密度较4周时有所下降,12周材料中央区密度下降明显,接近周围组织,边缘均有连续性骨痴,材料降解。16周时材料降解明显,已与周边连成一体B组术后2周与周围松质骨近似,8周周围有骨痴生长,边界不清;16周B组中央已部分吸收,边缘硬化。N组2-8周缺损区明显,12周、16周边缘模糊似有新骨,但骨缺损区明显大于B组。④骨磨片组织形态观察:术后8周、12周,M组4倍光镜下可见缺损区边缘已不规则,内部出现较多不规则蓝色骨小梁和类骨质,其中可见暗红色钙质沉着,提示为新生骨小梁;而B组材料不完整,呈小片分散状,仅边缘有少量新生骨小梁与类骨质。N组大部缺损仍存在,中心部位无新生骨小梁。⑤骨磨片组织荧光双标观察:术后8周、12周、16周,M组植入区边缘和中央可见较多绿色和金黄色荧光带;有散点状、不规则环形、“双轨征”,提示有新骨长入,且生长活跃;绿、黄荧光带间距接近20微米（2种示踪济相隔7天）,提示新骨生长速度较快。B组荧光以边缘区为主,缺损区中央可见1-2条状荧光,较M组少。N组只在边缘区见少量荧光。⑥组织形态学观察:M组术后2周植入材料区大量细胞聚集为主;4周边缘区有新骨生长,活性生长空间（AGC）内见骨样组织、小血管和大量细胞聚集,材料已部分降解吸收,剩余人工骨裂解成颗粒状晶体散在其中;8周时材料AGC部位骨细胞增殖活跃,新骨相互连接成片状;12周缺损区新骨进一步重建,纵切面见新骨样组织形成“框”形架,呈向“框”架内延伸;16周见AGC区形成髓腔样结构,周围大量新生骨样组织和血管。B组术后各时程新骨形成量较M组少,缺损区材料逐渐分离成片状,4周以后宿主骨缺损端见新生骨组织;N组4周后边缘见少量新骨,但缺损中央未见新骨生长,代之以大量纤维结缔组织填充。各组各时间点均未见植入区周围有炎性细胞聚集。⑦免疫组织化学观察:实验中取M组三个时间点（4周、8周、12周）取样,免疫组化分析M组材料与缺损交界区BMP2含量变化,结果显示三个时间点在边界区均有内源性BMP2分布,同时在材料中央孔区均有外源性BMP2着色。利用Motic Images Advanced3.2图像分析软件,对各组样本免疫组化结果通过灰度扫描进行半定量分析,数据经统计学处理显示:三个时间点的BMP2含量的灰度值均无显著差异。结论:①在体实验显示该复合材料生物相容性较好,能复合活性骨生长因子缓慢释放;②在复合材料中AGC的构建使诱导成骨呈多点生长趋势,有利缩短新骨生长距离,加速骨缺损修复;③复合材料植入机体后可降解并持续促进新骨生长,诱导成骨效果强于同种异体冻干骨。