猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组基因工程疫苗的研制

论文题目: 猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组基因工程疫苗的研制

论文类型: 博士论文

论文专业: 预防兽医学

作者: 袁改玲

导师: 才学鹏

关键词: 囊虫病,疫苗侯选基因,毕赤酵母诱导表达,免疫效果

文献来源: 中国农业科学院

发表年度: 2005

论文摘要: 囊虫病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫—猪囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)感染猪或人而引起的人畜共患寄生虫病。是联合国卫生组织列为需要根除的六大疾病之一。目前,研制有效的猪囊虫疫苗来控制和消除流行于世界各地的囊虫病是世界各国普遍关注的焦点。 本研究从孵化并激活的猪带绦虫六钩蚴中提取总RNA,利用RT-PCR技术在国内首次克隆了猪带绦虫六钩蚴疫苗侯选基因TSOL18基因。选用近年来发展最快和最具潜能的真核表达系统-毕赤酵母,构建了重组表达载体pPIC9K-TSOL18,电转化毕赤酵母菌种GS115,并用G418抗性梯度筛选法,获得多拷贝重组菌株。对重组菌株用甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,诱导表达的培养上清中表达出大小为12ku和16ku具有反应活性的重组蛋白。用糖苷内切酶H(Endo-H)对TSOL18蛋白分析后表明,目的蛋白进行了适度的糖基化修饰。通过对发酵条件如pH、温度和溶氧水平等的调整,重组毕赤酵母在5L发酵罐高细胞密度发酵中表达量达2.54g/L,用薄层扫描分析,目的蛋白约占培养上清蛋白总量的80%以上。 在猪带绦虫疫苗研究中,首次应用具有天然蛋白特性的真核表达产物进行动物保护试验。将TSOL18重组抗原与206佐剂结合,制成猪囊虫基因工程疫苗,对猪作了两批免疫试验。试验一中,重组抗原在用206作为佐剂的基础上,分别加上细胞因子(IL-4和IFN-γ)和CpG DNA作为免疫增强剂免疫仔猪,在免疫后15 d攻虫感染。在实验二中,加大了重组抗原TSOL18的免疫剂量,且选择在抗体水平较高时攻虫感染。结果显示,试验各组抗体水平在免疫后15d就呈强阳性,40d达到峰值,而且可保持抗体阳性达150d左右。从免疫保护效果来看,试验一中,TSOL18+206佐剂组减虫率仅为70%,远远低于粗制抗原组;而在试验二中,TSOL18+206佐剂组减虫率高达94%,高于粗制抗原组(89%)。这表明用毕赤酵母表达的猪带绦虫六钩蚴重组抗原疫苗具有广阔的推广应用前景,有望成为预防猪囊虫病的一种新型生物制剂。 用pcDNA3.1/IFN-γ重组质粒作为猪囊虫重组抗原免疫增强剂,抗体检测结果没有明显升高,但免疫猪后淋巴细胞增殖非常明显,并明显增强了疫苗的保护效果,该组免疫猪减虫率高达91%,与粗制抗原免疫组相同。而用pcDNA3.1/IL-4和pUC18/CpG作为免疫增强剂,虽然明显增强了疫苗的抗体水平,但免疫猪淋巴细胞增殖不太明显,且对免疫保护作用也没有明显的增强作用,两组减虫率分别为68.7%和67%,远远低于粗制抗原免疫组。说明IFN-γ对猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组抗原具有疫苗增强效应,这为以后选择猪囊虫疫苗的免疫增强剂提供了理论依据。

论文目录:

第一章 引言

1.1 研究背景

1.2 研究目的和意义

第二章 猪带绦虫六钩蚴TSOL18基因的克隆及表达

2.1 材料与方法

2.1.1 菌种和质粒

2.1.2 主要试剂

2.1.3 培养基和溶液

2.1.4 仪器与设备

2.1.5 TSOL18基因的克隆

2.1.6 TSOL18基因编码蛋白结构的预测

2.1.7 pPIC9K／TSOL18重组表达载体的构建

2.1.8 重组表达载体pPIC9K-TSOL18电转化毕赤酵母GS115

2.1.9 重组酵母菌株的诱导表达

2.1.10 重组蛋白TSOL18的糖基化分析

2.1.11 重组蛋白TSOL18的免疫活性分析

2.1.12 重组蛋白TSOL18的纯化

2.2 结果

2.2.1 TSOL18基因的RT-PCR扩增

2.2.2 TSOL18基因编码蛋白结构的预测

2.2.3 重组表达载体pPIC9K-TSOL18的构建及鉴定

2.2.4 重组毕赤酵母菌株的筛选

2.2.5 重组蛋白TSOL18的诱导表达及鉴定

2.2.6 重组蛋白TSOL18的糖基化分析

2.2.7重组蛋白TSOL18的免疫活性分析

2.2.8 重组蛋白TSOL18的纯化

2.2.9 重组菌种的稳定性和重组蛋白TSOL18的保存期观察

2.3 讨论

第三章 猪IFN-γ、IL-4真核表达载体的构建

3.1 材料与方法

3.1.1 菌种和载体

3.1.2 主要试剂

3.1.3 真核表达质粒pcDNA3.1／IL-4、pcDNA3.1／IFN-γ的构建

3.1.4 重组表达载体pcDNA3.1质粒大批量提取与纯化

3.2 结果

3.2.1 猪IFN-γ、IL-4真核表达载体pcDNA3.1的构建

3.2.2 重组真核表达载体pcDNA3.1质粒提取及纯化

3.3 讨论

第四章 疫苗的免疫效果及免疫增强剂的效应试验

4.1 材料与方法

4.1.1 实验动物和虫卵

4.1.2 主要试剂和溶液

4.1.3 抗原的制备

4.1.4 小鼠的免疫实验

4.1.5 家猪的免疫实验

4.1.6 抗体的检测

4.1.7 猪T淋巴细胞增殖试验

4.2 结果

4.2.1 免疫小鼠抗体水平的动态变化

4.2.2 免疫猪抗体水平的动态变化

4.2.3 T淋巴细胞增殖试验

4.2.4 剖检结果

4.3 讨论

第五章 结论

第六章 文献综述

外源基因在毕赤酵母表达系统中的优化策略及应用

参考文献

附录

致谢

作者简历

发布时间: 2005-09-05

参考文献

• [1].豆状带绦虫不同发育阶段的结构特征及其致病机理的研究[D]. 范希萍.甘肃农业大学2013

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