论文摘要
卵母细胞的低温保存是指在低温条件下抑制卵母细胞的新陈代谢活动，并使卵母细胞长期保存而不丧失活性的一种保存技术。该技术对于人类的辅助生殖以及动植物优良品种的保存，具有非常重要的作用。但是，目前卵母细胞玻璃化保存的存活率和发育率依然不高，距离临床应用还有一定的距离。本文对卵母细胞玻璃化保存的冷冻和复温过程进行了深入地研究，紧紧抓住提高冷冻过程的冷冻速率和减少复温过程中的再结晶两条主线开展研究，旨在最大限度地减少低温保存过程中冰晶对细胞的伤害，提高卵母细胞的存活率和发育潜能。Cryotop为目前卵母细胞玻璃化保存效果最好的方法，但是其冷冻过程的冷冻速率和复温过程的再结晶都有进一步改进的空间，本文以Cryotop法玻璃化保存卵母细胞，开展了以下研究工作：（1）首先利用数值模拟方法，分析了Cryotop在冷冻过程中的冷冻速率的影响因素。结果发现随着载体厚度的降低，液滴体积减少，冷源温度降低，换热系数增加，Cryotop在冷冻过程中的冷冻速率逐渐增加。当载体厚度为60μm，溶液体底面圆半径为120μm，冷源温度66K，换热系数为15,000W/（m2k）时，冷冻速率最高可以达到172,000K/min。其次使用数字示波器和单根线径25μm的T型热电偶搭建了快速测温系统，实测了液滴为0.5μL时不同厚度塑料（PVC）Cryotop载体的冷冻速率，发现冷冻速率随载体厚度降低而增高，60μm时最高，可达16,000±1,100K/min；100μmPVC在浆态氮中冷冻速率为17,000±1,200K/min，比在普通液氮中高41.7%，100μm铜片载体在普通液氮中冷冻速率可达16,000±1,200K/min，较100μmPVC载体提升33.3%。测量值和模拟值有较大出入，主要是由于液滴大小和换热系数取值不同造成。（2）使用不同厚度的Cryotop载体玻璃化保存猪MⅡ期卵母细胞，60μm和80μm的Cryotop载体得到卵母细胞的存活率分别为71.7±3.5％，69.3±6.5％，与厚度为100μm的标准Cryotop（存活率70.7±4.9％）没有显著性差异；使用标准Cryotop载体分别在-201℃和-207℃的浆态氮条件下冷冻猪MⅡ期卵母细胞，发现两实验组的存活率分别为68.6±8.2%和68.8±2.6%，同在普通液氮的冷冻的对照组（实验结果为69.2±4.0%）没有显著性差异；使用厚度为100μm厚度铜质载体保存GV期小鼠卵母细胞时发现，其存活率仅为15.6±5.0％，远低于相同厚度的标准Cryotop对照组（83.3±3.3%）。（3）使用低温显微镜研究实现了玻璃化的低温保护剂在升温过程中的结晶性质，结果发现升温速率的提高可以减少升温过程中的重结晶现象，缩小危险结晶区域。同时发现，较高浓度的保护剂的结晶形态对于细胞较为安全。将不同浓度的HA纳米颗粒加入到低温保护剂中，使用低温显微镜研究其在升温过程中的结晶性质，结果发现0.05%HA纳米颗粒的低温保护剂在复温过程中可以减少冰晶的重结晶，对细胞不构成威胁，而不添加HA颗粒的低温保护复温过程中会造成重结晶，有较高的几率对细胞构成威胁，添加过量的HA（0.5%），降温过程中就能形成大量冰晶，可能危害细胞安全。使用DSC测量含有0.1%不同粒径的HA纳米颗粒的低温保护剂的结晶量发现， HA颗粒可以使得低温保护剂总结晶量显著降低。（4）采用超声波使二氧化硅（SiO2），羟基磷灰石（HA），三氧化二铝（Al2O3），二氧化钛（TiO2）纳米颗粒在低温保护剂中分散，分析影响纳米颗粒在低温保护剂中分散效果的影响因素。结果表明:TiO2和Al2O3分散效果较好，HA和SiO2分散效果略差； HA和Al2O3稳定性较差，只能随制随用，SiO2和TiO2稳定性相对较好，适合长期贮存；HA分散性随pH值增大而增大，而TiO2和Al2O3在中性pH条件下分散性最好，SiO2分散性受pH影响不大；HA在低温保护剂浓度为40%时分散效果最好， SiO2、Al2O3在低温保护剂浓度高时分散效果好，TiO2分散性在低温保护剂浓度为80%时最强。（5）将纳米低温保护剂用于卵母细胞的玻璃化保存，分析纳米颗粒的毒性、以及纳米颗粒的种类、粒径、浓度对猪卵母细胞玻璃化保存的存活率和发育潜能的影响。结果表明不同种类的纳米颗粒对细胞的毒性阈值不同，HA浓度低于0.5%时对细胞没有毒性，而SiO2、Al2O3、TiO2在0.1%以下没有毒性；HA纳米颗粒能显著促进玻璃化保存，当浓度为0.1%时，猪GV期卵母细胞发育率可以达到22%；20nm、40mm、60nmHA纳米颗粒均可以提高猪GV期卵母细胞发育率，分别为26.7%、28.7%、28.7%，不同粒径的纳米颗粒保存效果没有显著差异；添加0.01%0.5%HA均能提高猪GV期卵母细胞发育率，其中添加0.05%HA玻璃化保存效果最好，发育率为30.4%；添加0.1%20nm、40nm、60nm HA纳米颗粒的低温保护剂均能促进猪MⅡ期卵母细胞存活率，结果均高于80%，不同纳米颗粒的保存效果差异不显著。