论文摘要
1.研究背景与目的食管癌（Esophageal carcinoma,EC）是我国最常见的六大恶性肿瘤之一,其中食道鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是最常见的一种组织学类型。食管癌的发病具有明显的地域分布特征,林州市及其毗邻的辉县、安阳等地是我国及世界上ESCC发病率最高的地区之一。显著的地域分布差异是食管癌突出的流行病学特征,提示环境因素在食管癌发生中可能起主要作用。值得提出的是林州地区食管癌家族积聚现象比较明显。河南林州移民流行病学提示,从林州迁移到其他地区100年后,食管癌和癌前病变检出率与林州当地居民相似,这些结果均提示遗传因素可能影响食管癌的发生。但是目前对遗传因素在食管癌发生中的作用仍不清楚,更未发现与食管癌遗传密切相关的候选基因和蛋白。食管癌另一个主要特征是高死亡率,大多数人在临床上确诊之后生存时间不超过一年,其5年生存率小于10%。然而如能早期诊断并得到及时治疗,其5年生存率可达到90%。食管癌是一个多阶段演进、多基因变化累积和叠加综合作用的结果,尽管目前的研究发现了许多与EC相关分子改变,如癌基因、抑癌基因、转移基因、凋亡基因等,但是尚未找到与EC直接相关的特异分子改变,并且食管癌发生、发展的分子机制仍不十分清楚。在形态学上,食管癌的发生发展经历了食管粘膜上皮基底细胞过度增生（basal cell hyperplasia,BCH）、不典型增生（Dysplasia,DYS）和原位癌（Carcinoma in situ,CIS）,这些形态学改变是EC高易感人群癌变早期的重要特征,并将这些病变称之为食管的癌前病变。EC的早期诊断实际上是发现癌前病变患者,尤其是不典型增生和原位癌直接影响EC的发病率和死亡率;在这个阶段采取治疗,可使EC的死亡率直接下降。食管胃镜检查虽然能够在一定程度上提高早期食管癌的检出率,但是胃镜检查的痛苦大、成本高,不适于大样本高危人群的筛查。因此筛选和建立用于高危人群的预警和早期诊断的生物学技术、方法和指标,缩小内镜检查范围,然后再进一步检查是十分重要的。蛋白组学技术通过研究特定组织中或细胞中表达的全部蛋白质,具有高通量和高灵敏度等特点,特别适合肿瘤标志物的筛选研究;同卵双胞胎是研究基因、基因-遗传因素影响食管癌发生的最好模型,因为通过对双胞胎食管癌和癌前病变的研究,能够全面评价遗传因素在食管癌中发生的作用,同时加深了解遗传和环境因素在食管癌发生、发展的互相关系。本研究通过对高发区同卵双胞胎进行流行病学调查、胃镜组织病理学检查,免疫组化分析,及对高发区双胞胎食管癌患者、散发食管癌患者、散发贲门癌患者进行磁珠蛋白组学比较,探讨遗传和环境因素在食管癌发生中的作用,探索新的可能用于早期食管癌诊断和高危人群筛选的蛋白分子标记物。2.材料与方法2.1研究对象同卵双胞胎流行病学调查,资料完整的108对双胞胎。男50对,中位年龄45岁,女58对,中位年龄45岁。自愿接受胃镜检查的双胞胎有22对,其中患食管癌的双胞胎有4例,胃癌1例（全部为单发）。散发食管癌5例,来自河南省林州市中心医院,男3例,中位年龄55岁,女2例,中位年龄49岁。散发贲门癌组5例,来自河南省安阳肿瘤医院,男4例,中位年龄65岁,女1例,61岁。健康对照组20例,高发区非患癌双胞胎作为健康对照组,均为胃镜检查和活检病理证实排除食管癌。其中8例亦无食管炎等食管良性疾病。2.2样本（血清、组织）的收集2.2.1血清:所有检测对象均取5ml空腹静脉血,将血清与血凝块分装,-80℃冰箱保存。特别指出,取血样前,每例检查对象均排除急慢性炎症（肝炎,发热等）等疾病。2.2.2食管内镜检查和粘膜活检组织对自愿接受胃镜检查的双胞胎常规食管内镜检查,分别在食管中段（距门齿25cm处）、下段（食管、贲门交界处,齿状线上2cm处）、贲门和胃窦各取两块活检组织,并在肉眼可见病变处（碘染色不染区）随机取材,一块常规组织学处理,另一块-80℃冰箱保存备用。双胞胎食管癌、胃癌及癌旁组织来自安阳肿瘤医院、林州市中心医院、新乡市中心医院,双胞胎食管组织来自胃镜检查的活检组织。2.3方法2.3.1流行病学调查:主要采用问卷入户调查方式,调查内容主要包括:一般情况（年龄、性别、通讯方式）,双胞胎家族史,食管癌家族史,疾病史,生活饮食习惯,一般体格检查（身高、体重、脉搏、血压等）项目,同意抽血者抽血5ml,同意胃镜检查者进行胃镜检查。2.3.2卵性鉴定:采用问卷调查结合相似诊断法,排除异卵双生及资料不齐全的双胞胎。2.3.3双胞胎食道、贲门粘膜组织病理学诊断:根据细胞形态和组织结构的变化特征,将食管鳞癌的癌旁组织分类为正常（NOR）,基底细胞过度增生（BCH）,间变/不典型增生（DYS）三级;贲门腺癌的癌旁组织分类为正常贲门上皮（NOR）,慢性萎缩性胃炎（CAG）,间变/不典型增生（DYS）三级。经二位病理专家确诊。2.3.4 Microflex和ClinProTools蛋白芯片检测血清蛋白质组2.3.4.1样品的准备（1）4℃冰箱取出铜螯合磁珠悬浮液一管,手动上下摇动,完全混匀磁珠悬浮液,1分钟（2）取出5ul磁珠加入200ul样品管,再加入50ul铜螯合磁珠结合缓冲液（BS）。（3）向样品管中加入20ul铜螯合结合缓冲液,再加5ul血清。（4）多肽样品溶液移入干净的0.5ml样品管,可用于直接质谱分析。2.3.4.2准备标准品（1）准备10mM醋酸铵(77mg醋酸铵溶解在100ml Milli-Q水中;（2）如下混合:5ul（25ul）Peptide Calibration StanDard;20ul（100ul）10mM醋酸铵;25ul（125ul）Protein Calibration StanDardⅠ;（3）充分混合1min后每5ul一管,分装,-20度保存。2.3.4.3准备基质（1）配置（1g/L）的HCCA,丙酮溶解;（2）配置终基质溶液0.3g/L,乙醇/丙酮=2/1;（3）基质溶液要当天配置,新鲜使用。2.3.4.4标准品谱图的生成（1）采集范围1～13kDa,误差±5Da。（2）激光能量根据实验室质谱而定,一般采用高激光能量轰一下结晶点,再用低于高激光能量10～20%的能量采集图谱（3）同一标准品结晶靶点,不同结晶点,多点采集,累加5～10个结晶点数据,得到累加后的标准品图谱,平均分子量偏差小于100ppm。2.4免疫组织化学分析:对食管粘膜、癌旁组织、食管癌组织分别检测p53,PCNA。采用卵白素-生物素-辣根过氧化氢酶复合物（ABC）。3.结果3.1双胞胎流行病学调查结果及22对同卵双胞胎食管、贲门、胃组织病理学检查结果:共调查479对双胞胎,其中资料完整的108对,男50对,年龄为27～63岁,中位年龄45岁,女58对年龄为19～72岁,中位年龄45岁。共发现13人患恶性肿瘤,其中食管癌7例,肝癌1例,胃癌1例,胆管癌2例,淋巴瘤和骨肉瘤各1例。除1对双胞胎同时患胆囊癌外,食管癌及其它肿瘤全部为单发。食管癌家族史调查,发现11对双胞胎食管癌家族史阳性,7例双胞胎食管癌患者有5例食管癌家族史阳性。体重质量指数（BMI）、身高资料完整的108对双胞胎中,60对BMI值一致（BMI±1）,男女之间无差异。22对双胞胎中只有5对双胞胎两者之间病理结果完全一致,其中3对为慢性轻度食管炎,1对为慢性浅表性胃炎,1对为正常。恶性肿瘤患者共有5例:TW096B,TW097B,TW098B,TW099A均为食管鳞癌,TW002B为胃窦管状腺癌;癌前病变:TW096A为食管中段DYS、食管下段轻度BCH;TW097A为胃体重度肠上皮化为生（IM）、贲门IM、DYS、食管中段DYS、食管上段轻度DYS;TW002A为慢性轻度食管炎、贲门慢性浅表性胃炎伴轻度不典型增生、胃窦慢性浅表性胃炎;TW040B为Barrett食管改变;TW077A为慢性轻度食管炎,慢性萎缩性胃炎伴肠化;TW107A为慢性萎缩性胃炎;癌及癌前病变患者在双胞胎中均为单发。其余大都具有慢性轻度食管炎或慢性浅表性胃炎。3.2双胞胎食管癌Microflex、ClinProTools血清蛋白组比较结果3.2.1双胞胎中患食管癌者与非患癌者:TW096B（ESCC）与TW096A共出现92个差异蛋白,其中上调蛋白48个,下调蛋白44个;TW097B（ESCC）与TW097A共出现84个差异蛋白,其中上调蛋白49个,下调蛋白35个;TW098B（ESCC）与TW098A共出现83个差异蛋白,其中上调蛋白67个,下调蛋白16个。其中在三例食管癌中同时表达的差异蛋白有16个,其分子量为:1450.61 Da,1546.24Da,4090.35 Da,4192.84 Da,4209.20 Da,4673.53 Da,5398.55 Da,5904.17 Da,5965.86 Da,6033.29 Da,6089.22 Da,7767.12 Da,7829.23 Da,8143.70 Da,8936.12Da,9293.30 Da。3.2.2三对患食管癌的双胞胎之间共有差异蛋白16个,与正常相比分子量相同（±5Da）且都为上调或都为下调,其中都为上调的蛋白有:4090.35Da,4192.84Da,4209.20Da,4673.53Da,5398.55Da,5904.17Da,5965.86Da,6033.29Da,6089.22Da,7767.12Da,7829.23Da,8143.70Da,8936.12Da,9293.30Da,其中都为下调的蛋白有:1450.61Da,1546.24Da3.2.3 3例双胞胎食管癌与20例健康双胞胎差异蛋白相对含量比较时发现有统计学意义（P＜0.05）的差异蛋白有3个,其分子量分别为1779.04 Da,5905.29 Da,5967.68 Da;3例双胞胎食管癌与8例健康人差异蛋白相对含量比较:按ROC/AUC统计处理,AUC面积＞0.95的差异蛋白有13个,其分子量分别为1692.12 Da,1779.03 Da,2951.75 Da,3241.47 Da,5905.03 Da,5966.85 Da,9294.42 Da,2660.77Da,2932.58 Da,3192.02 Da,3263.02 Da,3882.19 Da,5807.33 Da;5例散发食管癌与20例健康双胞胎差异蛋白相对含量比较时发现有统计学意义（P＜0.05）的差异蛋白有5个,其分子量为:1779.1 Da,4287.48 Da,1929.57 Da,1866.43 Da,1881.41 Da;5例散发贲门癌与8例健康人差异蛋白相对含量比较:按ROC/AUC统计处理,AUC面积＞0.95的差异蛋白有4个,其分子量为:2660.46 Da,4963.83Da,5807.01 Da,6090.41 Da。3.3免疫组化分析:（双胞胎p53,PCNA结果）从正常食管上皮→基底细胞过度增生（BCH）→间变（DYS）→鳞状细胞癌（ESCC）,随着病变程度加重,P53蛋白阳性表达呈上升趋势,且半定量也逐渐升高,3例食管癌患者都为P53阳性（弥漫型）,1例胃癌患者P53表达为阳性（乳头型）,其余食管炎伴肠上皮化生3例,2例P53阳性;慢性食管炎13例,9例P53蛋白阳性。双胞胎之间,两者P53均为阳性占7对,但其P53半定量结果有较大差异,P53均为阴性占1对。3例食管癌患者癌组织中PCNA均大于50%,胃癌患者组织中大于25%,其余除两例阴性外,PCNA均小于25%。4.结论:（1）流行病学调查7例食管癌患者在同卵双胞胎全部为单发,组织病理学检查各对双胞胎之间一致性较低,提示河南食管癌高发区环境因素可能是食管癌发生的重要因素。（2）三对双胞胎中食管癌患者与对照组对比发现有16个相同的差异蛋白,这些蛋白可能成为筛选高危人群的候选蛋白。（3）p53、PCNA在双胞胎食管癌患者中的表达高于对照组及癌旁组织,p53、PCNA是食管癌高发人群最早出现的分子改变之一。但各对双胞胎之间差异很大,提示在食管癌的发生发展中,环境因素的作用可能更大。
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