核呼吸因子基因的克隆表达及单克隆、多克隆抗体的制备

论文摘要

肿瘤能量代谢最显著的特征是糖的有氧氧化能力显著下降和糖的无氧酵解能力显著增强,近年来研究发现该现象与肿瘤细胞线粒体结构与功能的异常有关,其分子生物学机制还不明确。线粒体是细胞产生能量的主要部位,由呼吸酶链氧化磷酸化完成其产能功能,呼吸酶各亚基由线粒体基因组和核基因组共同编码,核呼吸因子（nuclear respiratory factors, NRFs）在两基因组间起协同转录调控作用,是保证线粒体功能完整性的重要转录因子,然而肿瘤能量代谢障碍是否与NRFs对线粒体呼吸链亚基转录调节方面的异常有关未见报道。本课题以人肝癌细胞系SMMC 7721的cDNA为模板,克隆了NRFs和mtTFA （mitochondrial transcription factor A）基因编码区。构建了NRFs的原核表达载体,NRF-1的真核表达载体和NRF-1的RNA干涉载体,对NRF-1进行了原核表达,制备了兔抗人NRF-1多克隆抗体和鼠抗人NRF-1单克隆抗体,为研究NRF-1及其靶基因的变化规律,观察其对肿瘤细胞能量代谢及增殖和凋亡的影响,揭示NRF-1对肿瘤线粒体呼吸功能的转录调节机制,奠定了实验基础,提供了研究工具。1.采用RT-PCR技术从人肝癌细胞系SMMC 7721的cDNA中克隆NRF-1、NRF-2α、NRF-2β和mtTFA的基因,经测序与GenBank公布的序列一致;构建NRFs的原核表达载体,并对NRF-1进行原核表达与分离纯化,获得NRF-1的纯化蛋白,免疫动物,制备兔抗人NRF-1多克隆抗体和鼠抗人NRF-1单克隆抗体。我们采用His蛋白对抗体中针对His蛋白的成分进行交叉吸收,中和抗体中针对His蛋白的成分后,ELISA结果表明,兔的多克隆抗体和鼠的单克隆抗体分别在1:8000和1:16000的情况下仍能够与抗原NRF-1的蛋白结合;Western blot结果显示兔抗人NRF-1多克隆抗体和鼠抗人NRF-1单克隆抗体均能够与NRF-1的融合蛋白特异性结合;免疫组化结果显示:我们制备的兔抗人NRF-1多克隆抗体与商品化的多克隆抗体一样可以特异性地识别乳腺癌中的NRF-1抗原。2.构建NRF-1真核绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C3-NRF-1,将之转染Hela细胞,融合表达的EGFP -NRF-1的绿色荧光定位于细胞核。根据siRNA的设计原则,利用软件设计siRNA片段,装入RNA干涉载体pSilencerTM3.1 H1 neo,用脂质体瞬时转染的方法检测其对NRF-1基因表达的抑制情况,RT-PCR和Western blot结果显示,转染48 h后NRF-1的表达开始降低,72 h后降低较为明显,将RNA干涉载体命名为pSilencer-siNRF-1。本研究成功地克隆了NRFs和mtTFA的基因,并对NRF-1进行了原核表达,在国内首次制备了NRF-1兔的多克隆抗体和鼠的单克隆抗体。构建了NRFs的原核表达载体,NRF-1的真核表达载体和NRF-1的RNA干涉载体,为研究NRF-1及其相关基因的变化规律,观察其对肿瘤线粒体呼吸功能和能量代谢的影响,揭示NRF-1的转录调节机制,奠定了实验基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验材料
• 1.细胞系及菌株
• 2.质粒
• 3.主要试剂
• 4.实验仪器
• 5.主要溶液配制
• 实验一 NRFs基因的克隆、原核表达及抗体的制备
• 1 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验二 NRF-1 真核表达载体和RNA干涉载体的构建及表达
• 1 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢