牦牛重组干扰素表达及其生物学活性研究

论文摘要

干扰素-α（interferon-α）和干扰素-β（interferon-β）属于Ⅰ型干扰素,分别由活化的白细胞和成纤维细胞产生,具有广谱的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性;干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）为Ⅱ型干扰素,主要由活化的T淋巴细胞和NK细胞产生,丝裂原以及抗原特异性刺激T淋巴细胞克隆也可产生,它具有广泛抗病毒、抗细胞内寄生菌及胞内寄生虫、抗肿瘤和免疫调节作用,在机体免疫系统中发挥重要作用。由于Ⅰ型、Ⅱ型干扰素在疾病的诊断、治疗、预防和疫苗免疫效果检测等方面均具有重要作用,因此它是现代分子生物学、免疫学和临床医学研究的热点之一。本研究通过RT-PCR技术克隆了牦牛干扰素-γ基因,并构建了原核表达质粒pET-30a-yakIFN-γ,用IPTG诱导表达并对其最佳诱导表达条件进行探索。结果表明:克隆的yakIFN-γ基因序列与GenBank上登录的牛IFN-γ基因序列的同源性为99%;表达的最佳条件为:在LB培养基中28℃诱导5h,诱导剂浓度为0.5mmol/L。然后用镍柱对可溶性表达产物进行亲和层析纯化,包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化;可溶性表达产物纯化后用SDS-PAGE、Western-blot分析证实得到了高纯度的重组yakIFN-γ。在对牦牛干扰素-?（yakIFN-α-A/Ⅱ和yakIFN-β）基因进行改造后,选用近年来发展最快和最具潜能的真核表达系统-毕赤酵母对这三个基因进行表达。首先分别构建了这三个Ⅰ型干扰素基因的重组表达载体pPIC9K-yakIFN-Ⅰ（pPIC9K-yakIFN-α-A、pPIC9K-yakIFN-α-Ⅱ和pPIC9K-yakIFN-β）用SalⅠ内切酶线性化,电转化毕赤酵母菌种GS115,使重组表达载体与宿主酵母染色体发生同源整合,并用G418抗性梯度筛选法,获得多拷贝重组菌株。对重组菌株利用甲醇进行诱导分泌表达,用SDS-PAGE分析表达情况,发现重组菌株分泌表达在72h时达高峰,分泌量可达180mg/L左右。对纯化的yakIFN-γ和yakIFN-Ⅰ（yakIFN-α-A、yakIFN-α-Ⅱ和yakIFN-β）重组蛋白的生物学活性研究表明:重组牦牛IFN有诱导刺激淋巴细胞增殖能力,其中yakIFN-γ诱导刺激能力比yakIFN-Ⅰ强;用yakIFN-γ和yakIFN-Ⅰ抗PRV生物活性研究发现,yakIFN-Ⅰ的抗病毒活性比yakIFN-γ强,同时yakIFN-α-A和yakIFN-β联合使用比单独使用抗PRV病毒活性强2倍,yakIFN-γ和yakIFN-β联合使用比单独使用yakIFN-γ抗PRV的活性强4倍。由此表明,本研究表达的yakIFN-γ、yakIFN-α-A、yakIFN-α-Ⅱ和yakIFN-β重组蛋白具有较高的、广泛的生物学活性,可以开发利用。我国是牦牛主产国,本研究为牦牛IFN （yakIFN）基因工程生物制品的进一步开发和相关疾病的治疗或预防奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一部分 文献综述
• 第一章 牛干扰素研究进展
• 1.1 引言
• 1.2 干扰素的产生与分类
• 1.3 干扰素的分子结构
• 1.3.1 牛干扰素的结构
• 1.3.2 牛干扰素受体
• 1.3.3 牛干扰素的信号转导途径
• 1.4 干扰素的生物学活性及其作用机制
• 1.4.1 相对的种属特异性
• 1.4.2 微弱的抗原性
• 1.4.3 高度的生物活性
• 1.5 牦牛重组干扰素发展前景
• 1.6 国内外研究现状
• 1.6.1 干扰素研究现状
• 1.6.2 牛干扰素的研究现状
• 第二章 外源基因在毕赤酵母中的表达
• 2.1 巴斯德毕赤酵母（P. pastoris）表达系统及特点
• 2.2 外源基因在 P. pastoris 中表达的影响因素及优化策略
• 2.2.1 P. pastoris 表达载体的选择
• 2.2.2 P. pastoris 宿主菌
• 2.2.3 高效表达启动子
• 2.2.4 信号肽及其选择
• 2.2.5 P. pastoris 表达载体中的选择标记
• 2.2.6 表达载体与P. pastoris 染色体的整合
• 2.3 影响外源基因在P. pastoris 中表达的其他因素
• 2.3.1 外源基因的内在特性
• 2.3.2 表达条件的优化
• 2.3.3 提高外源蛋白在毕赤酵母表达分泌过程中修饰和加工能力
• 第二部分 试验研究
• 第三章 牦牛干扰素-γ基因的克隆、表达及其蛋白纯化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验动物、菌种和载体
• 3.1.2 酶和试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 溶液
• 3.1.5 仪器与设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 牦牛外周血淋巴细胞的分离与培养
• 3.2.2 淋巴细胞的刺激诱导
• 3.2.3 总RNA 的提取
• 3.2.4 RT-PCR 扩增目的片段
• 3.2.5 目的基因的克隆
• 3.2.6 重组质粒的提取与鉴定
• 3.2.7 重组表达载体的构建
• 3.2.8 重组菌的诱导表达、最佳表达条件的优化及SDS－PAGE 电泳分析
• 3.2.9 纯化表达产物的检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 淋巴细胞的体外刺激活化
• 3.3.2 RNA 提取结果
• 3.3.3 RT-PCR 产物
• 3.3.4 重组克隆载体的鉴定
• 3.3.5 牦牛IFN-γ序列测定及分析
• 3.3.6 重组表达质粒的鉴定
• 3.3.7 表达产物的检测
• 3.4 讨论
• 第四章 牦牛Ⅰ型干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 菌株与载体
• 4.1.2 主要酶和试剂
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 仪器与设备
• 4.1.5 pPIC9K-yakIFN-Ⅰ重组表达载体的构建
• 4.1.6 重组表达载体pPIC9K-yakIFN-Ⅰ电转化毕赤酵母G5115
• 4.1.7 重组酵母菌株的诱导表达
• 4.1.8 表达产物的SDS-PAGE 分析
• 4.1.9 表达的yakIFN-Ⅰ的纯化
• 4.1.10 yakIFN-Ⅰ所编码蛋白糖基化及磷酸化位点预测
• 4.2 结果
• 4.2.1 重组载体pPIC9K-yakIFN-Ⅰ的构建及PCR 和双酶切鉴定
• 4.2.2 重组酵母菌株 G5115/ pPIC9K- yakIFN-Ⅰ的鉴定
• 4.2.3 摇床水平上重组酵母菌表达产物的SDS－PAGE 检测
• 4.2.4 目的蛋白的纯化
• 4.2.5 yakIFN-Ⅰ基因所编码蛋白糖基化及磷酸化位点预测
• 4.3 讨论
• 第五章 重组牦牛干扰素的生物学活性分析
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 实验细胞和病毒
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 溶液
• 5.1.4 仪器与设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 细胞的培养
• 5.2.2 yakIFN-γ和yakIFN-Ⅰ重组蛋白促淋巴细胞转化
• 5.2.3 PRV 病毒毒价测定
• 5.2.4 重组yakIFN-γ和yakIFN-Ⅰ抗PRV 病毒活性分析
• 5.2.5 yakIFN-γ抑制PRV 病毒诱导 MDBK 细胞调亡
• 5.3 结果
• 5.3.1 重组牦牛干扰素诱导淋巴细胞增殖
• 5.3.2 PRV 病毒毒价的测定
• 5.3.3 重组yakIFN 抗病毒活性测定
• 5.3.4 干扰素抑制细胞凋亡试验结果
• 5.4 分析与讨论
• 第六章 研究结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介