靶向ING1基因的miR-622真核表达载体在胃癌细胞MKN-45中的鉴定及其功能研究

论文摘要

背景：胃癌是消化道中常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均高,在全部恶性肿瘤其死亡率位于第二位,严重威胁着人民的生活质量和生命健康。胃癌的发生及其发展是复杂的,包括多种免疫与分子机制。胃癌发生的分子机制研究中发现癌基因和抑癌基因在胃癌发生发展中发挥着重要作用,但其表达调控机制尚不清楚。微小RNA（microRNA,miRN A）是近年来新发现的一类非编码小分子RNA,研究发现它们不仅在生物体的生长、发育、衰老、死亡等各个生物过程的起到一定的调控作用,在肿瘤的发生和发展中也发挥着重要的作用。目的：miRNA的发现使人们对肿瘤发生发展有了新的认识,已有研究报道,胃癌中也存在广泛的microRNA表达失调。miR-622是胃癌microRNA中一种,miR-622的研究发现miR-622直接靶向细胞周期相关基因ING1。本研究旨在构建miR-622真核表达载体,建立高表达miR-622的稳定转染胃癌细胞株,验证miR-622转染人胃癌MKN-45细胞后对靶向细胞周期ING1基因的干扰效果并验证miR-622相关功能。方法：1.以人胃癌细胞株MKN-45基因组为模板,通过PCR技术获取miR-622前体目的片段。pSuper.gfp/neo载体中插入miR-622前体目的片段构建miR-622真核表达载体。2.将真核表达载体pSuper/miR-622经过相应的酶切位点转染到人胃癌MKN-45细胞中,并经过含有G418的培养液筛选出稳定转染细胞株,高表达miR-622的稳定转染MKN-45细胞株被建立。稳定转染转染MKN-45细胞株：MKN-45-pSuper/miR-622组,对照组为转染空质粒细胞：MKN-45-pSuper组及未处理细胞MKN-45组。通过实时荧光定量PCR进一步验证实验组及对照组miR-622的表达情况。3.通过Western blot检测NG1蛋白水平表达,检测其对ING1基因表达的干扰效果；通过CCK-8细胞增殖实验检测细胞增长情况；细胞周期实验验证miR-622高表达对胃癌细胞周期的影响。结果：1.pSuper空载体组ING1蛋白表达量为10.62±1.04,转染了pSuper/miR-622高表达质粒的MKN-45细胞中ING1蛋白表达量为2.32±0.31；转染了pSuper/miR-622实验组中ING1蛋白表达明显减少,与pSuper空载体组相比降低了4.58倍；2.CCK-8细胞增殖实验结果显示：转染了pSuper/miR-622实验组的MKN-45细胞与pSuper空载体相比,促进了胃癌细胞增殖。3.细胞周期实验的验证结果pSuper/miR-622组在胃癌细胞G0/G1期为21.45±0.16,pSuper空载体组在G0/G1期为48.21±0.34; pSuper/miR-622组在胃癌细胞G2/M期为53.67±0.41, pSuper空载体组在G2/M期20.27±0.18；高表达miR-622的pSuper/miR-622组与pSuper空载体组相比,其促进了胃癌细胞周期的演化。结论：miR-622真核表达载体构建以及稳定表达miR-622胃癌细胞的筛选成功,为进一步研究miR-622在胃癌中的功能奠定了实验基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附录
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表