论文摘要
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的细胞起源一直是许多研究者争论的问题。而从肝癌细胞起源角度探索肝癌发生的分子机制将为进一步理解肝癌发生发展的机理提供新的证据,同时也为寻找对预防、诊断和治疗有价值的新的分子标记提供线索。由于卵圆细胞和多种慢性肝病的关系密切,因此认为它是肝癌的细胞来源之一。本研究应用直接致癌剂亚硝基胍（N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG）和过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）联合作用大鼠卵圆样细胞WB-F344诱导其致瘤性转化,并采用基因芯片技术和经典的二维电泳结合质谱技术分别分析了卵圆细胞致瘤性转化过程不同时间点的基因表达谱和蛋白表达谱的变化,通过生物信息学分析发现增殖与凋亡的失衡、mRNA代谢/转录翻译的调节、代谢的改变等生物学过程可能在卵圆细胞致瘤性转化过程中发挥重要作用,与这些生物过程相关的基因或蛋白可能是转化过程中的关键因子,如磷酸酶及张力蛋白同源物（phosphatase and tensinhomolog,pten）、周期素依赖性蛋白激酶抑制因子1A（cyclin dependent kinaseinhibitor 1A,cdkn1a）、周期素依赖性蛋白激酶2（cyclin dependent kinase 2,cdk2）、caspase-8（casp-8）、不均一核糖核酸核糖核蛋白A281（heterogeneous nuclearribonucleoprotein A2/B1 isoform,HnRPA281）、不均一核糖核酸核糖核蛋白A3（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3,HnRPA3）、不均一核糖核酸核糖核蛋白D（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D,HnRPD）、Non-POU domain-containingoctamer-binding protein（NONO）和4型葡萄糖转运蛋白（glucosetransporter type 4,GLUT4）等,亦可能在肝癌的发生中起重要作用。第一部分大鼠肝卵圆样细胞WB-F344的致瘤性转化和鉴定本部分研究应用H2O2连续刺激（每周刺激一次,连续刺激21周）经直接致癌剂MNNG启动的WB-F344细胞（以下简称为“WB cells”）,诱导其发生致瘤性转化。光镜下观察转化细胞的形态学改变和转化灶的形成,应用透射电镜观察转化细胞超微结构特征;应用染色体核型分析检测转化细胞的遗传学改变;应用软琼脂克隆形成实验分别检测转化细胞WB-3、WB-5、WB-7、WB-11和WB-21（分别代表经H2O2刺激3周、5周、7周、11周和21周的细胞）的非停泊依赖生长特性;并用MTT法检测转化细胞的增殖能力,用流式细胞术（flow cytometry,FCM）测定转化细胞的细胞周期。结果显示经MNNG启动和过氧化氢刺激的WB细胞发生了致瘤性转化。形态学分析显示:在过氧化氢作用后第二周,光镜下观察到细胞出现明显的转化灶,排列紊乱、重叠交叉生长,丧失了接触抑制能力。电镜下,转化细胞呈多边形或立方形,与WB细胞比较含有更多的线粒体和滑面内质网等结构,出现微绒毛和缝隙连接。染色体核型分析显示转化细胞呈异倍体核型,50%左右的细胞染色体数目异常,从27到103条不等。软琼脂克隆形成实验表明转化细胞具有了非停泊性依赖生长的特性,且随着过氧化氢作用次数的增多克隆形成能力逐渐增强。WB-3、WB-5、WB-7、WB-11和WB-21五组细胞的克隆形成率分别为0,0.1%,0.3%,0.8%和2%。正常WB细胞则不能在软琼脂上生长。在H2O2作用后的第5周（WB-5）,细胞首先表现出软琼脂克隆生长,但克隆形成率较低,克隆较小;到第21周（WB-21）克隆形成能力明显增强,克隆较大。MTT检测结果表明转化细胞的增殖能力较对照组WB细胞明显增强（p＜0.000）。转化细胞较正常的WB细胞有更多的细胞处于细胞周期的S期和G2/M期,说明转化细胞的增殖能力旺盛。以上这些结果均提示经MNNG启动和过氧化氢刺激后,WB细胞发生了致瘤性转化,为进一步分析转化细胞的基因表达谱和蛋白表达谱的改变提供了基础。第二部分大鼠肝卵圆样细胞WB-F344致瘤性转化过程中的基因表达谱分析本部分旨在分析WB细胞致瘤性转化过程中不同时间点基因表达的变化,并探讨差异基因的生物学意义,从中揭示可能导致WB细胞发生转化的分子机制。选取正常WB细胞（对照组）、转化的WB-5（H2O2刺激5次,即作用第五周,首次出现软琼脂克隆生长）细胞和WB-21（H2O2刺激21次,即作用第21周,约有50%细胞染色体核型异常）细胞,分别提取细胞总RNA。应用SuperArray公司的大鼠癌通路发现者功能芯片（rat Cancer PathwayFinder oligo microarray）比较了上述三组细胞的基因表达谱的改变。共发现21个基因差异表达。应用实时定量PCR技术验证了cdkn1a、pten、casp-8和肿瘤坏死因子超家族成员b（tumor necrosisfactor receptor superfamily,member 10b,tnfrsf10b）在三组细胞中的表达,进一步证实了芯片结果的可靠性。用DAVID和GENIE ONTOLOGY数据库对差异基因进行功能注释,发现大部分差异基因产物都具有蛋白或核酸结合与信号转导活性,主要参与细胞周期、凋亡、细胞粘附运动等功能的调节。其中上调的基因包括cdk2、神经细胞黏着分子1（neural cell adhesion molecule 1,ncam1）等,下调的基因包括干扰素β1（interferon,beta 1,ifnb1）、干扰素α1（1interferon-alpha 1,ifna1）、十八型胶原α1（collagen,typeⅩⅧ,alpha 1,col18a1）等,而连续上调的基因有pten,连续下调的有cdkn1a,先上调再下调的基因有myc、fos、casp-8等。结合STRING数据库分析差异基因的相互作用提示细胞增殖与凋亡的失衡可能是导致WB细胞发生致瘤性转化的部分原因,而基因cdkn1a、cdk2、pten、casp-8等的改变可能与WB细胞的转化相关。第三部分大鼠卵圆样细胞WB-F344致瘤性转化过程中蛋白质组的动态变化本部分在基因水平研究的基础上,进一步从蛋白水平上探讨了WB细胞致瘤性转化过程中不同时间点的蛋白表达谱的改变,分析了差异蛋白的生物学意义,揭示可能在WB细胞转化过程中起关键作用的蛋白分子。选取正常WB细胞、转化的WB-5和WB-21细胞,提取总蛋白。应用非线性pH3-11,长13 cm的固定pH梯度的IPG胶条和12%SDS-PAGE对它们进行2-DE分离（每组细胞各重复3次）,结合蛋白考染技术获得三组细胞的总蛋白表达谱。应用Image Master软件对三组细胞的蛋白表达谱进行差异分析。在WB细胞中平均检测到1279±13个蛋白点、WB-5细胞中平均检测到1141±6个蛋白点,WB-21细胞中平均检测到1503±8个蛋白点,三组细胞的蛋白分布相似,多集中在pI 4～9,MV25～84 KDa区域。以其中2-DE效果好、点数多的一块胶作为参考胶,进行三组间两两比较匹配分析,WB、WB-5、WB-21三组细胞组间匹配的平均匹配点数分别为629±29个（WB/WB-5）,752±21个（WB/WB-21）和643±31个（WB-5/WB-21）,共筛选出差异大于或等于2倍的蛋白点148个。切取了132个差异蛋白点进行MALDI-TOF-/MS/MS分析,通过数据库搜索、比对并去冗余后,共鉴定出差异蛋白81个,其中WB和WB-5两组细胞比较出差异蛋白29个,WB和WB-21两组细胞比较出差异蛋白41个,WB-5和WB-21两组细胞比较出差异蛋白27个。应用SWISSPROT（http://www.expasy.cn）、NCBI、EBI数据库对这些差异蛋白进行功能分类,并应用SWISSPROT和IntACT（http://www.ebi.ac.uk/intact）数据库对差异蛋白进行相互作用网络分析。发现正常WB细胞和转化的WB-5和WB-21细胞比较,差异蛋白主要参与代谢、氧化还原/应激反应过程。如参与代谢过程的醛脱氢酶A1（aldehyde dehydrogenase,dimericNADP-preferring,ALDH3A1）、苹果酸脱氢酶2（malate dehydrogenase 2,NAD,MDH2）等在转化细胞中表达升高,而腺苷酸激酶1（adenylate kinase 1,AK1）、磷酸甘露糖变位酶（similar to Phosphomannomutase 2,PMM-2）则表达降低;参与应激过程的丝氨酸蛋白酶抑制剂1（serine proteinase inhibitor,clade H,member1,SERPINH 1）、热休克蛋白8（heat shock protein 8,HSP7C）等在转化细胞表达增加,而peroxiredoxin 4（PRDX4）、PDZ and LIM结构域1（PDZ and LIMdomain protein 1,ELFIN）、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2,SOD2）等则表达下降。不同时间点转化细胞的差异蛋白则主要参与转录翻译/mRNA代谢调节、细胞粘附运动、氧化还原/应激反应以及细胞信号转导。而一组RNA结合蛋白均在WB-5中表达降低,在WB-21细胞中又表达升高,包括HnRPA281、HnRPA3、HnRPD。另一个RNA结合蛋白NONO则在三组细胞表达连续升高,蛋白相互作用网络分析提示NONO可能通过HnRPK与40S ribosomal protein SA（RPSA）、HSP7C、PRDX3、ATP synthase,H+transporting,mitochondrial F1complex,beta polypeptide（ATP5b）存在相互作用。而4型葡萄糖转运蛋白（glucosetransporter type 4,GLUT4）则是相互作用网络中的一个共同节点。这个蛋白虽然不是我们鉴定出的差异蛋白,但很多差异蛋白都与它存在关系,推测可能通过它而发生相互作用。同时,我们应用免疫印迹法鉴定了细胞角蛋白8（CK8）和RPSA在三组细胞中的表达,结果与质谱一致。以上这些结果显示转录翻译/mRNA代谢调节、细胞运动粘附、氧化还原/应激反应、代谢等生物学过程可能在WB细胞转化过程中发挥作用。而调节mRNA代谢的一组RNA结合蛋白HnRPA281、HnRPA3、HnRPD、NONO可能在WB细胞的转化过程中扮演重要角色。参与葡萄糖转运的4型葡萄糖转运蛋白与多种差异蛋白存在相互作用,推测可能与WB细胞的转化相关。结论1.大鼠卵圆样细胞WB-F344在MNNG和过氧化氢联合作用下发生了致瘤性转化。2.建立了正常WB细胞、转化的WB-5、WB-21细胞的总蛋白表达谱;分析了WB细胞致瘤性转化过程中不同时间点的基因表达和蛋白表达的变化。3.在转化过程中发生改变的基因主要参与调节细胞增殖、凋亡、细胞粘附运动等;发生变化的蛋白主要与代谢过程、转录翻译/mRNA代谢、细胞粘附运动、氧化还原/应激反应等生物过程相关,说明这些生物学过程可能在WB细胞的致瘤性转化过程中发挥重要作用。4.结合生物信息学分析发现细胞增殖与凋亡的失衡可能是导致WB细胞发生致瘤性转化部分原因,其中cdk2、cdkn1a、pten、casp-8等基因可能是关键因子;另外,一组RNA结合蛋白HnRPA281、HnRPA3、HnRPD、HnRPA1及NONO和4型葡萄糖转运蛋白（GLUT4）可能与WB细胞的转化和肝癌的发生相关。潜在应用价值1.从细胞起源角度探讨肝癌发生,为进一步理解肝癌发生的分子机制提供了新证据。2.筛检出的差异基因和差异蛋白有可能成为新的预防或诊断的分子标记,并为进一步探索肝癌治疗的新靶点提供了线索。创新点1.首次建立了大鼠卵圆样细胞WB-F344和其转化细胞WB-5、WB-21的总蛋白表达谱。2.从肝癌细胞起源的角度来探讨肝癌的发生,进一步揭示了卵圆细胞与肝癌的关系。3.运用基因芯片和比较蛋白质组学手段,分析了WB细胞转化过程中基因表达和蛋白质表达谱的动态变化,发现增殖与凋亡的失衡、代谢、转录翻译/mRNA代谢、细胞骨架、氧化还原/应激反应等生物过程可能是WB细胞转化的原因,一组RNA结合蛋白HnRPA281、HnRPA3、HnRPD及NONO等和4型葡萄糖转运蛋白以及cdk2、cdkn1a、pten、casp-8等基因可能与转化或肿瘤的发生关系密切,为探索治疗的新靶点提供了线索。4.基因表达谱和蛋白表达谱两者互为补充,更有助于理解WB细胞致瘤性转化的分子机制。
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