论文摘要
近年来,定向进化技术的迅猛发展,给基因工程带来新的革命,由于其中最重要的一步必须有极大多样性的突变体库的建立,使核苷酸类似物这一研究工具在这一新生领域中又发挥了不可缺少的重要作用。本课题从核苷酸类似物这一独特的视角出发,首次应用核苷酸类似物5-BrdUTP作为PCR体外随机突变的诱变剂的方法,在原有的实验基础上,对核苷酸类似物5-BrdUTP的突变机理进行了进一步的探讨和研究。5-BrdUTP在体外可以代替dTTP,并可低效率的代替dCTP,与腺嘌呤和鸟嘌呤的错配,造成突变。实验结果表明,5-BrdUTP可以产生12种可能的单碱基替换突变类型中的8种（A:T, A:G, A:C, T:C, G:A, G:C, C:A, C:T）。包括4种转换类型和4种颠换类型。主要突变类型为A:T→G:C （72.9%）。同时还包括碱基插入和缺失突变类型,其中还包括大片段的缺失。本文报道的关于5-BrdUTP致突变的新结论主要为以下几点:（1）以野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）野生型淀粉酶基因为模板的体外突变中存在突变热点;（2）突变频率可以通过改变5-BrdUTP加入PCR反应体系中的浓度来控制;（3） 5-BrdUTP突变谱有一定的偏倚性,但产生的突变类型多样,其中即包括转换,也包括颠换。因此本诱变方法是一种有效的构建多样性的突变体库的方法。从上述方法构建的α-淀粉酶基因突变体库中筛选到一个截短突变体酶Xa-S2。从Xa-S2基因DNA序列推导的氨基酸序列有167个残基,只有野生型α-淀粉酶Xa-WT（475个残基）大小的35%,二级结构预测的结果显示Xa-S2无法折叠成完整的（β/α）8桶状催化结构域,并且失去了野生型淀粉酶的3个催化活性位点,但仍然具有淀粉酶的水解活性。将Xa-S2和野生型淀粉酶基因分别构建到大肠杆菌表达载体pET30a（+）,得到重组质粒pXAS2和pXAWT,并转化大肠杆菌菌株BL21（DE3）,用IPTG诱导表达,得到纯化的Xa-S2和Xa-WT蛋白后,对两个酶的酶学性质进行了研究。结果表明Xa-S2的Km值为32 mg/mL,最适pH为6.2,最适反应温度为30℃。而野生型酶Xa-WT的Km值为8 mg/mL,最适反应pH范围为5.96.2,最适温度范围为4550℃。高效液相色谱（HPLC）分析其对淀粉的最终水解产物类型均包含葡萄糖和麦芽糖,并以葡萄糖为主。但Xa-S2与Xa-WT相比,在保留时间为8.0min位置多出一个产物峰。预示着两种酶作用于底物的方式有所不同。二级结构和三级结构预测的结果表明,野生型淀粉酶具有完整、典型的淀粉酶13家族的（β/α）8桶状催化结构域,3个催化残基和4个典型保守区域,而Xa-S2只包含桶状结构的部分结构单元,即N-端的βαβαβ单元。因此,Xa-S2为首次发现的只包含小于半桶状结构的结构单元组成的有酶活性的蛋白,这对于（β/α）8桶状结构家族的结构与进化关系的研究意义重大。将黑曲霉（Aspergillus niger）葡萄糖淀粉酶GA-I的SBD结构域序列与野生型淀粉酶基因用PCR的方法融合,得到融合酶基因XAGsbd,构建到毕赤酵母表达载体pPIC9K,得到重组质粒pPICXAGsbd,转化毕赤酵母（Pichia pastoris） GS115后,获得了整合型分泌表达α-淀粉酶的重组菌株GS115（XAGsbd）,对获得的融合蛋白进行酶学性质研究和生淀粉水解能力的研究结果表明,其最适反应条件分别为pH5.96.2和4550℃,水解生淀粉的速率可以最高达到21% （30h）。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析结果表明融合蛋白被高度糖基化。用生淀粉吸附的纯化方法纯化后,并用2%β-环糊精溶液洗脱可得到纯化的蛋白。将一个编码的淀粉酶活性提高的突变基因,克隆到由rDNA序列介导的酵母整合型表达载体pHBM368上,得到重组质粒pHBM368XA,转化酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVScI后,获得了整合型分泌表达α-淀粉酶的酵母重组菌株S.cerevisiae INVScIXA01。对选择的3个工程菌α-淀粉酶表达的稳定性进行了检测,结果表明在完全培养基中连续培养80代,淀粉酶的酶活性仍然保持稳定。在淀粉酶自身信号肽引导下,胞外分泌效率可达50%。