转基因番茄标记基因剔除及翻译起始因子4E基因顺化植物的病毒抗性

论文摘要

作物遗传改良依赖于向植物基因组导入外源DNA片段。虽然基因工程赋予植物很多通过常规育种途径无法实现的优良性状，人们对转基因作物及其植物产品心存疑虑。植物转基因研究中抗性标记基因可以提高转化体的筛选效率。其中70％转基因植物中采用卡那霉素抗性标记基因。然而，对抗性标记基因潜在的生物安全性疑虑阻碍了植物转基因研究的发展，同时现有可利用的标记基因种类有限性也阻碍了转基因作物的长期利用。解决抗性标记基因安全性问题的策略有标记回避和标记剔除两类，前者是在转化阶段不使用抗性标记基因或采用安全标记基因筛选转基因植株；后者则采用抗性标记基因筛选获得转化体后剔除标记基因。在剔除策略中，可诱导的自主剔除途径显现出较好的利用前景。棉铃虫是一种寄主极广的农业大害虫，在蔬菜生产区主要危害番茄。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）毒蛋白（insecticidal crystal protein，ICP）基因是目前应用最为广泛的抗虫基因。本研究内容之一旨在以番茄为受体，通过构建化学诱导剔除载体系统用于从抗虫转Bt基因植物中剔除标记基因。对作物遗传改良的另外一个疑虑是关于外源基因。对于这种顾虑使得研究人员考虑是否能够向植物基因组导入植物自身基因，而不含其他物种基因，即顺化基因植物（cisgenic plant），以区别于转基因植物（Transgenic plant）。植物病毒病给世界各地的农作物生产造成严重损失。随着植物翻译起始因子特别是eIF4E的研究深入，植物抗病毒研究将面临新的课题。病毒侵染寄主植物并在植物体内进行自我复制和增殖需要借助寄主自身蛋白质合成机制。通过植物基因工程途径，干扰病毒利用植物mRNA翻译蛋白质的过程，可抑制病毒在寄主植物内的复制和增殖，不仅可获得抗病毒植物材料，而且可加深对植物-病毒互作分子机理的认识。鉴于此，本研究第二部分内容通过克隆真核翻译起始因子4E相关基因，利用基因失活和正义表达顺式调控植物自身eIF4E表达，提高植物对马铃薯Y病毒属病毒的抗性，探讨eIF4E介导的抗病毒性的作用机理。本实验主要开展以下研究：1．利用位点特异重组系统Cre／lox和化学诱导系统XVE相结合构建标记基因剔除载体p35C，在该系统中，反式激活因子XVE、重组酶基因cre、标记基因nptⅡ构建于识别序列loxP正向重复之间，AVE由位于左侧loxP上游的花椰菜花叶病毒35S启动子驱动，cre由β-雌二醇特异诱导的启动子驱动，在右侧loxP下游构建无启动子的cryIAc基因。β-雌二醇诱导处理后，β-雌二醇与反式激活因子XVE结合，启动cre基因表达，Cre重组酶识别loxP正向重复位点，发生重组反应，导致两个loxP之间的cre、nptⅡ以及XVE同时剔除，将剩下一个loxP位点，同时将cryIAc基因置于35S启动子驱动下。在载体p35G中，目的基因为gfp，用于通过绿色荧光蛋白检测标记基因的剔除。2．通过农杆菌介导的方法进行番茄遗传转化。p35G载体转化番茄中，19个抗性芽，经过于β-雌二醇诱导后，有2个再生芽可以观测到绿色荧光蛋白的表达，表明该诱导自主剔除系统适用于番茄转化。通过p35C载体将cryIAc导入番茄品种“中蔬五号”获得抗性芽，将抗性芽转移至含有2μMβ-雌二醇诱导培养基中生根。选取携带单拷贝转基因番茄植株进行鉴定，对4个转基因株系的T1进行分析，重组频率一般在12％～39％之间，完全重组的频率8％～30％，将标记基因nptⅡ和cre基因剔除。重组区域序列分析与预期的重组反应一致。其中株系C4所发生的重组皆为不完全重组。另外，利用λ噬菌体的两个重组位点attP构建正向重复序列，置于标记基因两侧，结果表明在转基因当代和T1代均未检测到重组植株，可能是由于重组加强序列影响其重组效率。3．部分转cryIAc基因植株的Northern blot结果表明，多数转基因植株cryIAc的正常转录。4．在转基因番茄叶片中表达量为3500 ng g-1 FW～6300 ng g-1 FW，而在果实中CryIAc含量较叶片低，介于2400 ng g-1 FW～4400 ng g-1 FW之间。对转基因植株的抗虫性初步鉴定表明，对棉铃虫具有较强的抗性。幼虫校正死亡率在70％～90％之间，转基因株系的抗虫指数在80％～90％之间。5．分别从克隆了番茄品种“中蔬五号”和抗病辣椒的真核翻译起始因子4E编码基因。中蔬五号番茄所获得的eIF4E与报道的序列有3个碱基差异，而辣椒eIF4E与报道序列一致。6．构建了辣椒eIF4E正义（超量）表达载体（pCA4S）及番茄eIF4E RNAi抑制表达载体（pLE4D）。7．以番茄品种“中蔬五号”为受体，通过农杆菌介导的方法用pCA4S和pLE4D两种载体进行遗传顺化，获得卡那霉素抗性顺化植株13株。PCR检测和Southernblot结果表明，目标基因已整合到番茄基因组中。pCA4S载体同时用于辣椒品种苏椒五号的遗传顺化，4株再生辣椒PCR检测呈阳性，初步确认基因已整合到番茄基因组。由于在此实验中所用目的基因eIF4E来自番茄和辣椒自身，我们暂且称所获得的基因工程植株为基因顺化植株（cisgenic plants），尽管它们还携带非植物自身基因。8．通过半定量RT-PCR对基因顺化番茄进行eIF4E表达分析，表明pCA4S顺化番茄中eIF4E得到超量表达，而pLEAD顺化番茄中eIF4E表达受不同程度抑制。9．利用摩擦接种对番茄顺化植株进行PVY和CMV攻毒感染。通过对接种后的病毒病病情调查和病毒RNA的半定量RT-PCR分析，结果表明，pLE4D和pCA4S顺化植株相对于对照均获得不同程度的病毒抗性。其中pCA4S顺化植株的抑制病毒效果较差，而pLE4D顺化植株的效果较好。就不同病毒而言，无论是正义表达eIF4E或者eIF4E RNA干涉，对PVY抗性的调控效果比CMV调控效果好。10．对本实验中获得的基因顺化辣椒材料以及本实验室所创建转基因顺化辣椒进行PVY和CMV攻毒感染。结果表明pLE4D和pCA4S转化植株相对于对照均获得不同程度的病毒抗性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 课题的提出
• 1.2 标记基因安全性策略
• 1.2.1 直接转化筛选法
• 1.2.2 采用安全标记基因
• 1.2.2.1 甜菜碱醛脱氢酶基因
• 1.2.2.2 葡糖醛酸酶基因
• 1.2.2.3 木糖异构酶基因
• 1.2.2.4 磷酸甘露糖异构酶基因
• 1.2.2.5 ipt基因和rol基因
• 1.2.2.6 甜椒类铁氧还蛋白基因
• 1.2.3 剔除标记法
• 1.2.3.1 共转化
• 1.2.3.2 转座子
• 1.2.3.3 同源重组
• 1.2.3.4 位点专一重组系统
• 1.2.4 标记基因安全性策略发展趋势
• 1.3 植物基因化学诱导表达系统
• 1.3.1 植物基因化学诱导表达类型
• 1.3.1.1 四环素诱导系统
• 1.3.1.2 四环素失活系统
• 1.3.1.3 基于糖皮质素受体的类固醇诱导系统
• 1.3.1.4 基于雌激素受体的类固醇诱导系统
• 1.3.1.5 双向调控系统
• 1.3.1.6 基于脱皮激素受体的杀虫剂诱导系统
• 1.3.1.7 基于AlcR的乙醇诱导系统
• 1.3.1.8 基于ACEI的铜诱导系统
• 1.3.2 化学诱导系统的应用
• 1.3.2.1 特异性超量表达研究
• 1.3.2.2 功能抑制研究
• 1.3.2.3 特定性功能互补
• 1.3.2.4 分离下游靶基因
• 1.3.2.5 无标记遗传转化
• 1.4 Bt抗虫转基因植物研究进展
• 1.5 植物抗病毒基因工程研究进展
• 1.5.1 病毒来源的抗性基因策略
• 1.5.1.1 外壳蛋白基因介导的抗性
• 1.5.1.2 利用病毒复制酶基因的抗性
• 1.5.1.3 运动蛋白基因
• 1.5.1.4 RNA介导的抗性策略
• 1.5.2 非植物病毒基因介导的抗性策略
• 1.5.2.1 α、β干扰素基因
• 1.5.2.2 利用核酶基因抗性策略
• 1.5.2.3 植物自身基因介导的抗病毒基因策略
• 1.6 植物真核翻译起始因子4E研究进展
• 1.6.1 真核翻译起始因子4E与蛋白质翻译起始
• 1.6.2 真核细胞蛋白质翻译起始机制
• 1.6.3 马铃薯Y病毒属病毒基因组
• 1.6.4 真核翻译起始因子4E介导的抗病毒机理
• 1.7 本研究的目的与内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 菌株、质粒及试剂
• 2.3 引物设计和序列分析
• 2.4 反转录PCR
• 2.4.1 总RNA的提取
• 2.4.2 RT-PCR
• 2.5 植物表达载体构建
• 2.5.1 正义表达载体构建
• 2.5.2 RNAi抑制表达载体的构建
• 2.6 番茄的遗传转化
• 2.7 辣椒的遗传转化
• 2.8 基因工程植株的分子检测
• 2.8.1 转化再生植株的PCR检测
• 2.8.2 基因工程植株的Southern杂交分析
• 2.8.3 基因工程植株的Northern杂交分析
• 2.9 基因工程植株的ELISA分析
• 2.10 基因工程植株抗虫性初步鉴定
• 2.11 基因工程植物的病毒接种及抗性鉴定
• 2.11.1 病毒来源
• 2.11.2 接种方法
• 2.11.3 病毒RNA RT-PCR检测
• 第三章 从转Bt基因番茄中诱导剔除标记基因
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 植物遗传转化载体的构建
• 3.2.2 番茄的遗传转化
• 3.2.3 转基因番茄的分子检测
• 3.2.4 转基因番茄的ELISA分析
• 3.2.5 转基因番茄的抗虫性鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 植物转化载体的构建
• 3.3.2 转基因植株的获得
• 3.3.3 转基因番茄植株的分子检测
• 3.3.3.1 转基因植株的PCR检测
• 3.3.3.2 转基因植株的Southern杂交分析
• 3.3.3.3 转基因植株的遗传分析
• 3.3.3.4 转基因植株的Northern杂交分析
• 3.3.4 转基因植株的ELISA分析
• 3.3.5 转基因植株的抗虫性初步鉴定
• 3.4 讨论
• 3.4.1 标记基因的诱导自主剔除
• 3.4.2 Bt蛋白抗虫的有效性
• 3.4.3 标记基因的其他安全性策略
• 第四章 真核翻译起始因子4E介导抗病毒特性研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 翻译起始因子4E基因克隆
• 4.2.2 植物正义表达载体的构建
• 4.2.3 植物干涉表达载体的构建
• 4.2.4 番茄和辣椒的遗传顺化
• 4.2.5 基因顺化植株的分子检测
• 4.2.6 基因顺化植株病毒接种和抗性鉴定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 翻译起始因子4E基因克隆
• 4.3.2 植物正义表达载体构建
• 4.3.3 植物干涉载体的构建
• 4.3.4 基因顺化植株的获得
• 4.3.5 基因顺化植株的PCR检测
• 4.3.6 顺化植株的Southern杂交检测
• 4.3.7 顺化植株的RT-PCR检测
• 4.3.7.1 辣椒正义基因顺化对内源基因表达的影响
• 4.3.7.2 RNAi对内源基因表达的影响
• 4.3.8 eIF4E干涉对番茄植株的病毒抗性的影响
• 4.3.8.1 基因顺化植株接种后症状表现
• 4.3.8.2 病毒RNA的RT-PCR分析
• 4.3.9 eIF4E正义基因顺化番茄植株的病毒抗性
• 4.3.9.1 基因顺化番茄接种后症状表现
• 4.3.9.2 病毒RNA RT-PCR分析
• 4.3.10 辣椒顺化植株的抗病毒特性的初步观察
• 4.4 讨论
• 4.4.1 关于本实验的研究策略
• 4.4.2 病毒检测技术
• 4.4.3 翻译起始因子的在病毒侵染中的作用
• 4.4.4 抗病毒基因工程的可行性
• 结语
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录一:登记基因信息
• 附录二:博士在读期间发表的论文及会议摘要