重组人白细胞介素24的表达及其生物学活性鉴定

论文题目: 重组人白细胞介素24的表达及其生物学活性鉴定

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物医学工程

作者: 杨珺

导师: 蔡绍皙,邹全明

关键词: 人白细胞介素,大肠杆菌表达系统,毕赤酵母表达系统,肿瘤细胞凋亡

文献来源: 重庆大学

发表年度: 2005

论文摘要: 1995年P．B．Fisher用差减杂交技术发现一个新的与人黑色素瘤分化相关基因，当时称为mda-7(melanoma differentiation-associated gene 7)，并发现随着黑色素瘤细胞生长、发展和转移，mda-7的表达逐渐减少至最终消失，证实了其表达产物MDA-7具有抑制黑色素瘤细胞增生、促进黑色素瘤细胞终末分化的能力。随后，MDA-7一直作为肿瘤抑制物被研究。直到2002年，Caudell等研究证实了MDA-7的细胞因子属性，重新命名为人白细胞介素24(Human interleukin-24，hIL-24)。迄今为止，已有大量实验证明hIL-24具有显著的选择性抑制多种肿瘤生长、诱导肿瘤细胞凋亡的能力，这种抑制作用不依赖p53、Rb和p16等抑癌基因的状态，且对正常细胞没有影响。hIL-24作为细胞因子，不仅在激活免疫细胞、调节整个抗癌免疫反应和造血系统中起重要作用，还具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡和直接抑制肿瘤细胞的增殖、转移作用，其显著的抗肿瘤特性使之成为肿瘤治疗研究的新热点。2004年，Introgen公司研制的基因治疗制剂Ad．IL-24，即重组复制缺陷型腺病毒-IL-24，商品名为INGN 241，获美国FDA批准进入Ⅱ期临床试验，体内外试验和临床实验均证实了hIL-24显著的抗肿瘤效果。随着对hIL-24作用机制和基因治疗方面深入的研究，一方面肯定了hIL-24生物学功能和治疗效果，另一方面表现出对hIL-24的大量需求，所以，通过基因工程手段大规模生产高纯度有活性的重组hIL-24成为必然。本研究分别采用大肠杆菌(原核)表达系统制备了融合蛋白Trx-IL-24，并用肠激酶酶切Trx-IL-24得到重组蛋白IL-24，以及采用毕赤酵母(真核)表达系统分泌表达了重组糖蛋白rIL-24，分析鉴定了三种重组蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性，为深入研究其诱导肿瘤细胞凋亡机制和肿瘤治疗应用奠定基础。 研究目的：构建hIL-24的大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统，获得三种重组蛋白Trx-IL-24、IL-24和rIL-24。建立Trx-IL-24和IL-24的制备、纯化及复性的中试生产工艺。筛选高效分泌表达rIL-24的重组毕赤酵母工程菌。鉴定三种重组蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性。 研究方法： 1) 人白细胞介素24基因的克隆 采用RT-PCR和nested-PCR方法，从ConA刺激培养的人外周血单个核细胞中，克隆带信号肽的hIL-24编码序列(hmIL-24)和不带信号肽的hIL-24编码序列(hIL-24)。 2) 人白细胞介素24基因在大肠杆菌中的表达与纯化 为避免引入多余的氨基酸，利用载体pET32a(+)上的肠激酶识别位点编码碱基之前的Kpn I位点，及多克

论文目录:

中文摘要

英文摘要

英文缩写对照表

1 绪论

1.1 研究意义与背景

1.2 IL-24研究现状

1.2.1 IL-24的基因与蛋白结构

1.2.2 IL-24的细胞因子属性

1.2.3 IL-24选择性肿瘤抑制机制

1.2.4 IL-24基因治疗临床试验进展

1.3 研究目的、研究内容和技术路线

1.3.1 研究目的

1.3.2 研究的主要内容

1.3.3 技术路线

2 人白细胞介素24基因的克隆

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 方法

2.3 结果

2.3.1 RT-PCR和巢式PCR扩增hIL-24和hmIL-24基因

2.3.2 重组质粒pMD18-hIL-24和pMD18-hmIL-24的构建

2.3.3 重组质粒pMD18-hIL-24和pMD18-hmIL-24的鉴定

2.4 讨论

3 人白细胞介素24在大肠杆菌中的表达与纯化

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 方法

3.2.2.1 融合蛋白Trx-IL-24的表达与纯化方法

3.2.2.2 IL-24的制备与纯化方法

3.2.2.3 IL-24多克隆抗体的制备方法

3.3 结果

3.3.1 融合蛋白Trx-IL-24的表达与纯化结果

3.3.2 IL-24的制备与纯化结果

3.3.3 IL-24多克隆抗体的制备与检测

3.4 讨论

3.4.1 Trx-IL-24在大肠杆菌表达系统中的表达特点

3.4.2 融合蛋白Trx-IL-24的纯化思考

3.4.3 复性条件与复性检测方法的选择

3.4.4 IL-24的制备策略

4 人白细胞介素24在毕赤酵母中的表达与鉴定

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 方法

4.3 结果

4.3.1 重组质粒的构建与鉴定

4.3.2 毕赤酵母重组子的筛选与鉴定

4.3.3 毕赤酵母重组子的诱导表达与鉴定

4.3.4 毕赤酵母重组子表达产物的糖基化分析

4.4 讨论

4.4.1 选用毕赤酵母系统表达rIL-24

4.4.2 影响外源基因在毕赤酵母中高表达的因素

4.4.3 重组蛋白rIL-24的糖基化特点

5 重组hIL-24的生物学活性测定

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 材料

5.2.2 方法

5.3 结果

5.3.1 MTT比色法测定肿瘤细胞增殖情况

5.3.2 荧光显微镜观察细胞形态的变化

5.3.3 DNA ladder实验

5.3.4 Western Blot分析凋亡蛋白Bax表达量

5.3.5 流式细胞仪定量分析肿瘤细胞凋亡

5.4 讨论

6 结论、创新性与展望

6.1 结论

6.2 创新性

6.3 展望

致谢

参考文献

附录1 攻读博士学位期间发表的论文目录

附录2 攻读博士学位期间科研成果

附录3 攻读博士学位期间参加科研项目

附图 DNA测序与氨基酸测序结果

独创性声明

学位论文版权使用授权书

发布时间: 2006-12-05

参考文献

• [1].人可溶性gp190 cDNA克隆、酵母表达系统的构建与生物学活性研究[D]. 黎刚.重庆医科大学2004
• [2].几种阳离子卟啉的生物学活性研究[D]. 秦艺旻.武汉大学2005
• [3].Flt3配体基因的克隆、表达及生物学活性鉴定[D]. 黄河.吉林大学2006
• [4].hBD3-BPI融合蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中的表达及其产物的纯化和生物学活性研究[D]. 庹晓晔.中国人民解放军军医进修学院2007
• [5].基因工程制备重组人胰高血糖素样肽-1及其生物学活性研究[D]. 张志珍.第二军医大学2002
• [6].成纤维细胞生长因子23及其拮抗剂蛋白的基因克隆、表达与生物学活性研究[D]. 刘孝菊.吉林大学2012
• [7].人血管内皮生长因子及其受体Flt-1功能域在巴氏毕赤酵母中的表达和生物学活性的研究[D]. 马骊.第一军医大学2000
• [8].建立组特异性过表达血栓调蛋白的小鼠模型[D]. 周千星.华中科技大学2011
• [9].胰岛素样生长因子-1基因表达及临床试验研究[D]. 段宇.南京医科大学2002

相关论文

• [1].利用毕赤酵母系统表达重组蛋白[D]. 于长明.中国人民解放军军事医学科学院2004
• [2].人纤溶酶原K5在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达、纯化与生物学活性研究[D]. 袁力勇.中国协和医科大学2001
• [3].重组人白细胞介素-15的原核表达和治疗肿瘤的研究[D]. 唐峰.中国协和医科大学2005
• [4].神经营养因子Neurturin在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性研究[D]. 李鸿钧.中国协和医科大学2003
• [5].rhIL-24对A375黑色素瘤细胞体内外抗肿瘤效应及其分子机理的研究[D]. 赵小瑜.苏州大学2006
• [6].白细胞介素27的克隆、功能与结构研究[D]. 胡鹏.重庆医科大学2006
• [7].hBD3-BPI融合蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中的表达及其产物的纯化和生物学活性研究[D]. 庹晓晔.中国人民解放军军医进修学院2007
• [8].MDA-7/IL-24选择性促进肝癌细胞凋亡和增殖阻滞及其机制研究[D]. 王从俊.华中科技大学2006
• [9].重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的表达、复性、纯化及中试生产工艺研究[D]. 李树刚.重庆大学2007
• [10].白细胞介素24抑制人胶质瘤细胞生长及对其化疗敏感性影响的体内外实验研究[D]. 王跃红.河北医科大学2008

标签：人白细胞介素论文;  大肠杆菌表达系统论文;  毕赤酵母表达系统论文;  肿瘤细胞凋亡论文;