菌群XM70宏基因组文库的构建及纤维素酶基因的克隆表达

论文摘要

纤维素酶作为食品工业、可再生能源以及其他工业生产中的广泛应用的酶,其生产一直是很多研究者不断探索的课题。目前投入生产的纤维素酶菌种只有几种,而且产酶量以及酶的催化特性等都还有很大的提升空间。本研究以本实验室从厦门温泉采集并以纤维素为底物,富集筛选得到的高效降解菌群为研究对象,通过构建宏基因文库技术,获得纤维素酶基因。在此基础上,通过基因重组将发现的基因在大肠杆菌中表达,以期构建一株新的高产纤维素酶的工程菌。首先,采用CTAB/NaCl法提取细菌菌群的DNA,经琼脂糖凝胶电泳和核酸微量测定仪等评价提取的DNA质量,满足实验要求后进入宏基因组文库构建步骤。宏基因组文库的构建选用了Epicentre Biotechnologies公司的CopyControl Fosmid Library Production Kit试剂盒,实验操作完全按照试剂盒操作说明,构建了宏基因组文库。之后挑取阳性克隆子,培养后,提取质粒并酶切观察酶切图谱,评估了所构建的宏基因组文库的片段插入率、插入片段大小以及插入片段稳定性等文库质量指标。评价结果显示,本实验所构建的宏基因组文库片段插入率较高,插入片段在研究的范围内,插入片段稳定性较好。在对宏基因组的初步测序结果的基础上,设计引物,以XM70菌群DNA为模板,扩增了纤维素酶基因,转入pGEX-4T-2表达载体中并转化大肠杆菌宿主细胞。DNA测序验证转化成功后,采用IPTG诱导的方式使重组纤维素酶基因大量表达。通过SDS-PAGE检测了重组蛋白的分子量；以超声波破碎发酵液细胞制备粗酶液,并对重组酶的酶学性质做了初步分析,结果显示：该重组纤维素酶的最适作用温度为70℃,最适作用pH为7.0,且其可发挥催化作用的温度范围和pH范围都较广。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 纤维素酶的应用现状
• 1.1.1 纤维素酶在食品工业中的应用
• 1.1.2 纤维素酶在生物质能中的应用
• 1.1.3 纤维素酶在其他生产中的应用
• 1.2 纤维素酶的研究现状
• 1.2.1 纤维素酶的分类和作用机制
• 1.2.2 纤维素酶的来源
• 1.2.3 产纤维素酶菌的研究现状
• 1.3 宏基因组文库的研究概况
• 1.3.1 未培养微生物
• 1.3.2 宏基因组技术
• 1.3.3 宏基因组文库的构建策略
• 1.3.4 宏基因组技术的应用
• 1.4 本课题的研究目的和意义
• 第二章 嗜热菌群XM70宏基因组文库的构建
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 宏基因组DNA的制备
• 2.2.2 XM70宏基因组文库的构建
• 2.2.3 宏基因组文库质量的检测评估
• 2.2.4 产纤维素酶阳性克隆子的初步筛选
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 菌群宏基因组DNA的提取和纯化
• 2.3.2 菌群宏基因组文库的构建
• 2.3.3 宏基因组文库质量评价
• 2.4 小结
• 第三章 耐高温纤维素酶基因的克隆表达
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验菌种及载体
• 3.1.2 实验仪器
• 3.1.3 主要实验试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.0 常用实验技术
• 3.2.1 纤维素酶基因的克隆
• 3.2.2 重组纤维素酶基因的诱导表达
• 3.2.3 重组纤维素酶的酶学性质分析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 纤维素酶基因的克隆
• 3.3.2 重组酶的诱导表达
• 3.3.3 酶学性质分析
• 3.4 小结
• 第四章 讨论与展望
• 4.1 讨论
• 4.1.1 XM70宏基因组文库的构建
• 4.1.2 XM70纤维素酶基因的克隆表达
• 4.2 展望
• 参考文献
• 附录Ⅰ 热稳定性纤维素酶产生菌群XM70初步研究信息
• 致谢