大蒜多糖及其硫酸化衍生物的抗病毒和增强免疫活性的比较

论文摘要

近年来医学研究发现,通过分子修饰可提高中药成分的生物活性,并能产生许多新的药用价值。一些天然多糖经过硫酸化修饰后得到了用途更为广泛的多糖衍生物,具有了或增强了原来不具有或活性很弱的生物活性。大蒜多糖本身具有抗病毒,增强免疫,抗氧化等方面的作用,为了追踪大蒜多糖抗病毒和增强免疫的活性部位,并且研究硫酸化修饰提高其抗病毒和增强免疫活性的可能性,本研究先采用柱层析法分级大蒜多糖,测定它们的体外抗病毒和增强免疫的活性,筛选出效果较好的多糖,进一步进行硫酸化修饰,比较其修饰前后抗病毒和增强免疫活性的变化。试验分为以下五个部分：试验1、大蒜多糖的提取和纯化采用热水浸提法从大蒜中提取大蒜粗多糖（GPSc）,经过Sevage法除蛋白后得到去蛋白的大蒜多糖（GPSp）,经DEAE-52纤维素柱分离得到中性大蒜多糖（GPSpl）和两种酸性多糖（GPSp2和GPSp3）,用苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝测定各多糖的糖含量和蛋白含量。结果表明,GPSc的提取率最高,达7.24%,糖和蛋白含量分别为68.35%和2.7%; GPSp的得率明显降低,为3.31%,糖含量升高,达91.2%,蛋白含量降低,为1.2%;GPSp1为中性多糖,得率进一步降低,为2.2%,糖含量最高,达95.83%;GPSp2和GPSp3的得率最低,分别为0.17%和0.16%,糖含量分别为86.03%和33.7%,蛋白含量分别为0.85%和4.9%。试验2、大蒜多糖抗病毒活性部位的体外筛选首先测定GPSc、GPSp以及三种分级多糖GPSpl、GPSp2、GPSp3对鸡胚成纤维细胞（CEF）的安全浓度,然后取安全浓度范围内5个浓度的5种多糖与鸡新城疫病毒（NDV）以3种加药方式（先加多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、多糖和病毒混合感作后加）加入到培养成单层的CEF中,用MTT法测定NDV感染CEF能力的变化。结果表明,先加多糖时,GPSc在0.78～1.56μg·mL-1、GPSp在3.125～12.5μg·mL-1能抑制显著NDV感染CEF（P<0.05）;后加多糖时,GPSc在1.56μg·mL-1、GPSp在0.78～6.25μg·mL-1、GPSpl和GPSp2在0.78～3.12μg·mL-1、能抑制显著NDV感染CEF（P<0.05）;多糖和病毒混合感作后加入时,GPSc在0.783～3.12μg·mL-1、 GPSp和GPSpl在0.78～6.25μg·mL-1、GPSp2在1.56μg·mL-1时能抑制显著NDV感染CEF （P<0.05）,而且GPSp组的显效范围最广,最高病毒抑制率高于其他各组。综合比较以GPSp的效果最好,可能是大蒜多糖抗病毒活性的最佳部位。试验3、大蒜多糖增强免疫活性部位的体外筛选取安全浓度范围内5个浓度的5种多糖加入到培养的鸡外周血淋巴细胞中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化（细胞A570值和淋巴细胞增殖率）。结果显示,单独作用时,GPSc和GPSp在0.78～6.25μg·mL-1、GPSp1在0.78～1.56μg·mL-1的细胞A570值显著大于细胞对照组（P<0.05）；与PHA共同作用时,GPSc在1.56～6.25μg·mL-1、GPSp在0.78～3.12μg·mL-1、GPSp1在1.56～3.12μg·mL-1、的细胞A570值显著大于PHA对照组（P<0.05）; GPSp在两种作用方式的淋巴细胞最高增殖率均较高。表明大蒜多糖在适当的浓度能单独或协同PHA促进淋巴细胞增殖,GPSp的效果最好,可能是大蒜多糖增强免疫活性的最佳部位。试验4、大蒜多糖的硫酸化修饰以产物量、糖含量和取代度（DS）为指标对大蒜多糖硫酸化修饰的主要条件试剂配比、反应温度和反应时间进行三因素三水平正交试验。结果表明,试剂配比对产物量影响较大,当氯磺酸-吡啶为1：4时,产物量最高；反应温度对糖含量和取代度影响较大,在45℃时糖含量最高,随温度上升糖含量逐渐下降；而取代度在45℃时最小,随温度的升高逐渐增高。试验5、硫酸化大蒜多糖抗病毒活性的体外比较首先测定正交实验所得9个硫酸大蒜化多糖（sGPSs）对CEF的安全浓度,然后以sGPSs和GPSp为比较对象,取安全浓度范围的5个浓度的9种硫酸化大蒜多糖和未修饰的GPSp与鸡新城疫病毒以3种加药方式加入到培养成单层的CEF中,用MTT法测定NDV感染CEF能力的变化。结果显示,先加多糖时,GPSp、sGPS5和sGPS6在3.125μg/ml能显著抑制NDV病毒感染CEF（P<0.05）, sGPS5组的病毒抑制率最高；后加多糖时,除sGPSl和sGPS2外,其余7组sGPS在一定浓度范围均能显著抑制NDV感染CEF（P<0.05）,sGPS5和sGPS6组的病毒抑制率最高,显著高于GPSp （P<0.05）;多糖与病毒感作后同时加时,9个sGPSs在一定浓度范围均能显著抑制NDV感染CEF （P<0.05）, sGPS5和sGPS8组的病毒抑制率显著高于GPSp和其余各组。表明硫酸化修饰能够提高大蒜多糖的抗病毒活性,综合比较以sGPS5的作用最强,其修饰条件为氯磺酸-吡啶为1：8、反应温度65℃、反应时间2h。试验6、硫酸化大蒜多糖增强免疫活性的体外比较取安全浓度范围内的5个浓度9个硫酸化大蒜多糖和未修饰的GPSp加入到培养的鸡外周血淋巴细胞中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果显示,单独作用时,各硫酸化大蒜多糖在一定浓度下均显著大于细胞对照组（P<0.05）,sGPS5和sGPS3的淋巴细胞增值率显著高于GPSp（P<0.05）;与PHA共同作用时,sGPS5、sGPS6、 sGPS8、sGPS9在一定浓度下显著大于PHA对照组（P<0.05）,sGPS5和sGPS9组的淋巴细胞增殖率显著高于其他各组sGPS（P<0.05）,且同样高于GPSp（P>0.05）。表明硫酸化修饰能够提高大蒜多糖的增强免疫活性,综合比较以sGPS5的效果最好,其修饰条件为氯磺酸-吡啶为1：8、反应温度65℃、反应时间2h。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及縮略语
• 第一章 文献综述
• 1 多糖的来源
• 1.1 动物多糖
• 1.2 植物多糖
• 1.3 藻类及微生物多糖
• 2 多糖的生物活性
• 2.1 增强免疫
• 2.2 抗病毒
• 2.3 降血糖和降血脂
• 2.4 抗肿瘤
• 2.5 抗凝血
• 2.6 抗溃疡
• 3 多糖的修饰方法
• 3.1 硫酸化修饰
• 3.2 烷基化修饰
• 3.3 乙酰化修饰
• 3.4 磷酸化修饰
• 4 大蒜及大蒜多糖
• 4.1 大蒜的活性成分
• 4.2 大蒜多糖的生物活性
• 5 本研究的目的意义
• 参考文献
• 第二章 大蒜多糖的提取和纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 试验药物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 大蒜多糖的提取
• 1.5 大蒜多糖的纯化
• 1.6 大蒜多糖的含量测定
• 1.7 大蒜多糖中蛋白含量的测定
• 2 结果
• 2.1 大蒜多糖的提取
• 2.2 大蒜多糖的纯化
• 3 讨论
• 3.1 大蒜多糖的提取方法
• 3.2 大蒜多糖的纯化方法
• 3.3 多糖和蛋白含量的测定方法
• 参考文献
• 第三章 大蒜多糖抗病毒活性部位的体外筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 多糖准备
• 1.2 病毒准备
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 1.5 主要器材
• 1.6 多糖对CEF安全浓度的测定
• 1.7 NDV感染CEF能力的测定
• 1.8 数据分析
• 2 结果
• 2.1 多糖对CEF的生长和最大安全浓度
• 2.2 先加多糖时NDV感染CEF能力的变化
• 2.3 后加多糖时NDV感染CEF能力的变化
• 2.4 多糖和病毒感作后同时加时NDV感染CEF能力的变化
• 3 讨论
• 3.1 先加多糖时NDV感染CEF能力的变化
• 3.2 后加多糖时NDV感染CEF能力的变化
• 3.3 多糖和病毒感作后同时加时NDV感染CEF能力的变化
• 3.4 大蒜多糖抗病毒作用的综合比较
• 参考文献
• 第四章 大蒜多糖增强免疫活性部位的体外筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 多糖准备
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试验方法
• 1.5 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 GPS单独作用时淋巴细胞增殖的变化
• 2.2 GPS与PHA共同作用时淋巴细胞增殖的变化
• 3 讨论
• 3.1 大蒜多糖单独作用时对淋巴细胞增殖的影响
• 3.2 大蒜多糖与PHA共同作用时对淋巴细胞增殖的影响
• 3.3 多糖含量对淋巴细胞增殖的影响
• 3.4 淋巴细胞增殖的测定方法
• 参考文献
• 第五章 大蒜多糖的硫酸化修饰
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂与仪器
• 1.2 因素水平确立
• 1.3 酯化试剂制备和酯化操作
• 1.4 硫酸基取代度的测定
• 2 结果
• 3 讨论
• 3.1 各因素对糖含量的影响
• 3.2 各因素对取代度的影响
• 3.3 各因素对产物量的影响
• 参考文献
• 第六章 硫酸化大蒜多糖抗病毒活性的体外比较
• 1 材料与方法
• 1.1 多糖准备
• 1.2 病毒准备
• 1.3 试剂与仪器
• 1.4 主要器材
• 1.5 硫酸化大蒜多糖对CEF的安全浓度测定
• 1.6 硫酸化大蒜多糖影响NDV感染CEF能力的测定
• 1.7 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 硫酸化大蒜多糖对CEF生长的影响和最大安全浓度
• 2.2 先加多糖时NDV感染CEF能力的变化
• 2.3 后加多糖时NDV感染CEF能力的变化
• 2.4 多糖与病毒感作后同时加时NDV感染CEF能力的变化
• 3 讨论
• 3.1 先加多糖对NDV感染细胞能力的影响
• 3.2 后加多糖对NDV感染细胞能力的影响
• 3.3 病毒和多糖感作后加时NDV感染细胞能力的影响
• 3.4 取代度对硫酸化大蒜多糖抗病毒作用的影响
• 参考文献
• 第七章 硫酸化大蒜多糖增强免疫活性的体外比较
• 1 材料与方法
• 1.1 多糖准备
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试验方法
• 1.5 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 硫酸化大蒜多糖单独作用时淋巴细胞增殖的变化
• 2.2 硫酸化大蒜多糖与PHA共同作用时淋巴细胞增殖的变化
• 3 讨论
• 3.1 硫酸化大蒜多糖单独作用时对淋巴细胞增殖的影响
• 3.2 硫酸化大蒜多糖与PHA共同作用时对淋巴细胞增殖的影响
• 3.3 硫酸化大蒜多糖增强免疫活性的比较及其修饰条件
• 参考文献
• 全文总结
• 论文创新点
• 致谢