乳源活性肽的研究 ——酪蛋白糖巨肽的酶法制备与分离纯化

论文摘要

酪蛋白糖巨肽（Casein Glycomacropeptide, CGMP）是一种乳源性生物活性肽，其多肽链中含有唾液酸等糖链，具多种生理活性功能和营养特性，广泛应用于保健食品和医药品。本研究以酪蛋白为原料，对CGMP进行酶法制备及其分离纯化的研究。研究结果如下：（1）以糖基化程度（唾液酸/蛋白，μg/mg）为指标，从胃蛋白酶、胰蛋白酶、凝乳酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味酶和HAP碱性蛋白酶7种蛋白酶中，筛选出胃蛋白酶作为酪蛋白制备CGMP的最佳用酶。（2）通过单因素分析，以透析后未透析液中唾液酸量为指标，对胃蛋白酶水解酪蛋白制备CGMP的条件进行优化，最适酶解条件为：37℃、pH2.5、酶与酪蛋白浓度比800U/g蛋白、酪蛋白浓度4%，水解2h时所制备CGMP的产量最高，其中唾液酸含量达49.53μg/mL，理论推算CGMP含量为0.61mg/mL。（3）用DEAE-cellulose DE-52阴离子交换层析（2×20cm）对CGMP粗品进行初步分离，用00.4mol/L NaCl的0.01mol/L pH6.8醋酸-醋酸钠缓冲液进行梯度洗脱，0.5mL/min，3mL/管。结果得4个蛋白洗脱峰，只有峰I（0.1mol/L NaCl的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱）含有唾液酸即CGMP。（4）用SephadexG-100凝胶柱层析法对CGMP进行进一步的分离纯化，分离条件为：0.1mol/L pH6.8醋酸-醋酸钠缓冲液平衡，0.25mL/min，1.5mL/管。结果得3个蛋白洗脱峰，其中只有峰I-1中含有唾液酸即CGMP。（5）纯化产物峰I-1经SDS-PAGE电泳测其分子量为30kDa左右，紫外吸收法测其纯度达92.1%。（6）确定了以酪蛋白为原料，酶法制备、分离CGMP的生产工艺。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 生物活性肽
• 1.1.1 按来源分类
• 1.1.2 按功能分类
• 1.1.2.1 生理活性肽
• 1.1.2.2 免疫活性肽
• 1.1.2.3 抗癌肽
• 1.2 乳源生物活性肽的研究进展
• 1.2.1 抗高血压活性肽
• 1.2.2 酪蛋白磷酸肽
• 1.2.3 类吗啡肽
• 1.2.4 免疫刺激肽
• 1.3 酪蛋白糖巨肽及其研究进展
• 1.3.1 酪蛋白糖巨肽的结构
• 1.3.2 酪蛋白糖巨肽的制备及分离纯化
• 1.3.3 酪蛋白糖巨肽的检测方法
• 1.3.4 酪蛋白糖巨肽的生理功能
• 1.3.5 酪蛋白糖巨肽的营养学特性
• 1.4 课题研究内容
• 第二章 产酪蛋白糖巨肽酶的筛选
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验试剂
• 2.1.2 实验仪器与设备
• 2.1.3 主要试剂的配制
• 2.1.3.1 酶活测定试剂配制
• 2.1.3.2 蛋白含量测定试剂配制
• 2.1.3.3 唾液酸含量测定试剂配制
• 2.1.3.4 酶解试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 蛋白酶活力的测定
• 2.2.1.1 标准曲线的绘制
• 2.2.1.2 酶活力测定
• 2.2.1.3 酶活力定义
• 2.2.2 蛋白质含量的测定
• 2.2.2.1 蛋白标准曲线的绘制
• 2.2.2.2 样品测定
• 2.2.2.3 计算
• 2.2.3 唾液酸含量的测定
• 2.2.3.1 唾液酸最大吸收波长的确定
• 2.2.3.2 半乳糖最大吸收波长的确定
• 2.2.3.3 唾液酸标准曲线的制作
• 2.2.3.4 样品测定
• 2.2.4 透析脱盐
• 2.2.4.1 透析袋的处理
• 2.2.4.2 透析脱盐
• 2.2.5 产酪蛋白糖巨肽酶的筛选
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 酶活力测定
• 2.3.2 唾液酸含量的测定
• 2.3.2.1 最大吸收波长的确定
• 2.3.2.2 唾液酸标准曲线的制作
• 2.3.3 产酪蛋白糖巨肽酶的筛选
• 2.4 讨论
• 第三章 酪蛋白糖巨肽的酶解条件优化
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验试剂
• 3.1.2 实验仪器与设备
• 3.1.3 主要试剂的配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 最适温度的确定
• 3.2.2 最适 pH 值的确定
• 3.2.3 酶与酪蛋白浓度比的确定
• 3.2.4 最适酪蛋白浓度的确定
• 3.2.5 反应时间对胃蛋白酶产酪蛋白糖巨肽的影响
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 温度对胃蛋白酶产酪蛋白糖巨肽的影响
• 3.3.2 pH 对胃蛋白酶产酪蛋白糖巨肽的影响
• 3.3.3 酶与酪蛋白浓度比对胃蛋白酶产酪蛋白糖巨肽的影响
• 3.3.4 酪蛋白浓度对胃蛋白酶产酪蛋白糖巨肽的影响
• 3.3.5 反应时间对胃蛋白酶产酪蛋白糖巨肽的影响
• 3.4 小结
• 第四章 酪蛋白糖巨肽的分离纯化研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验试剂
• 4.1.2 实验仪器与设备
• 4.1.3 主要试剂的配制
• 4.1.3.1 离子交换层析试剂配制
• 4.1.3.2 凝胶层析试剂配制
• 4.1.3.3 SDS-PAGE 电泳试剂配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 DEAE-52 阴离子交换柱层析[66]
• 4.2.1.1 活化
• 4.2.1.2 柱长的选择
• 4.2.1.3 装柱
• 4.2.1.4 平衡
• 4.2.1.5 上样
• 4.2.1.6 洗脱
• 4.2.1.7 收集与分析检测
• 4.2.1.8 柱的再生
• 4.2.1.9 分离条件
• 4.2.2 Sephadex G-100 柱层析[67]
• 4.2.2.1 凝胶的溶胀
• 4.2.2.2 装柱
• 4.2.2.3 平衡
• 4.2.2.4 上样
• 4.2.2.5 收集
• 4.2.3 酪蛋白糖巨肽分子量测定
• 4.2.3.1 SDS-PAGE 电泳
• 4.2.3.2 样品测定
• 4.2.4 酪蛋白糖巨肽纯度检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 DE-52 分离纯化酪蛋白糖巨肽
• 4.3.2 Sephadex G-100 进一步分离纯化酪蛋白糖巨肽
• 4.3.2.1 标准洗脱曲线的确定
• 4.3.2.2 Sephadex G-100 分离酪蛋白糖巨肽
• 4.3.3 酪蛋白糖巨肽分子量的确定
• 4.3.4 酪蛋白糖巨肽的纯度测定
• 4.4 讨论
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 存在的问题及展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录