高压氧预处理诱导大鼠脑缺血再灌注损伤耐受机制的研究

论文摘要

缺血性脑卒中具有高发病率、高致死率、高致残率,严重危害着人类健康,并给社会和家庭造成沉重的精神和经济压力。缺血性卒中的二级预防目前还没有很好的策略。因此人们对脑卒中的关注从“治”逐渐转移到“防”。脑卒中的一级预防日益引起重视。在尚未出现卒中或有危险因素时即给予干预,降低卒中风险,提高机体自身抵抗能力,以达到避免或减少卒中严重程度的目的。目前已经发现多种预处理方法可以诱导组织细胞对缺血再灌注产生耐受,包括缺血、低氧、HBO、高温、低温、睡眠剥夺、皮层传播抑制以及一些化学物质（如腺苷、内毒素、神经毒素、3-硝基丙酸等）,这些方法由于本身存在明显的毒性或副作用,在临床实际应用方面受到限制。HBO目前应用于一氧化碳中毒、减压病、动脉气体栓塞、也作为许多其他与氧供应降低相关的疾病的辅助性治疗,作为一种主要的治疗手段安全可行。HBO作为一种预防手段在临床上更有可行性。但有关高压氧诱导脑缺血耐受的机理研究比较缺乏,使其应用缺少必要的理论依据。本课题用线拴法建立大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型并经过改良,该模型为脑卒中的常用模型,大鼠与人脑血管结构相似,能很好的模拟人脑缺血再灌的过程。探讨HBO预处理诱导脑缺血耐受效应,通过症状学、病理、形态等不同指标分别评价HBO对皮层缺血半暗带和中心坏死区以及海马区的缺血耐受效应。从两方面探讨HBO预处理保护作用的机制:（1）反复高压氧预处理后活性氧自由基及相关抗氧化酶的变化。主要观察高压氧预处理后再经受缺血再灌注损伤24小时皮层的缺血半暗带和中心坏死区以及海马的氧化应激系统的变化;（2）反复高压氧预处理后线粒体途径的凋亡变化,测定线粒体途径的凋亡酶活性和凋亡相关蛋白变化。旨在为HBO预处理用于临床提供实验依据。第一部分高压氧预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护效应目的:研究短期的高压氧预处理方法对局灶性脑缺血再灌注损伤是否具有保护效应;同时观察皮层缺血中心区和半暗带以及海马对高压氧预处理不同程度的反应。方法:采用2.5 ATA,100%02,每天2次,连续2天的短期高压氧预处理方法,最后一次高氧后次日根据改良的Zea-Longa线栓法制作MCAO再灌注损伤模型。动物分为假手术组、MCAO组,HBO+MCAO组。造模后24 h观察各组动物的一般精神行为状态,体重变化,生存情况,根据Johansson和Garcia描述的神经学评分方法对神经功能缺损症状评估,测定脑组织含水量,TTC染色,并对脑组织进行灌流切片,行HE、NISSL和Spoerrl染色,并在镜下对神经细胞进行计数。结果:高压氧预处理组的动物在次日精神状态较好,毛色光滑,较为活泼,反应迅速,对水和食物的摄取也有较强的主动性,体重下降不如MCAO组明显（22.07±9.03g vs.33.60±9.53 g;P＜0.01）;生存率在高氧预处理后再受到缺血再灌注损伤打击时得到了显著提高（92%vs.78%;P＜0.05）;减轻了神经功能缺失症状（9.5±1.1vs.6.8±1.5;P＜0.05）;降低了缺血再灌注损伤后的脑组织含水量（0.78±0.01vs.0.86±0.02;P＜0.01）;缩小了梗塞面积（0.14±0.03 vs.0.21±0.04;P＜0.05）。HE,Spoerrl以及NISSL染色均表明HBO对皮层缺血半暗带（99.87±19.57vs.54.52±17.63,p＜0.05 NISSL）和海马（98.95±20.32vs.35.85±15.47,P＜0.01 NISSL）有较好的保护作用,但对缺血中心区保护作用不明显（34.57±8.62 vs.25.32±9.53,P＞0.05 NISSL）。结论:1、MCAO局灶性缺血再灌注模型制作方法相对简单,重复性好,能比较好的应用于预处理效果的比较;且该实验动物模型能提供清楚的缺血中心区和半暗带;2、短期的高压氧预处理方法对大脑中动脉缺血再灌注损伤有保护作用;3、高压氧预处理对缺血皮层半暗带和海马的保护作用优于缺血中心区。第二部分高压氧预处理后氧化应激系统对脑缺血再灌注损伤的保护作用目的:研究HBO预处理的保护效应是否与缺血应激后产生的ROS激发抗氧化酶的活性有关。方法:按照第一部分的方法进行高压氧预处理和造模。按已确立的24 h后MCAO模型大脑皮层缺血中心区和半暗带的分离方法对皮层和海马分别取材,制作组织匀浆,根据试剂盒说明用比色法测定脑组织中抗超阴离子氧活力和GSH-px活力,羟胺法测SOD活力,紫外比色法测CAT活力,TBA法测MDA含量。结果:高压氧预处理能提高缺血半暗带（369.22±25.94 vs.315.49±24.16,P＜0.05）和海马（381.19±27.54 vs.321.25±30.11,P＜0.05）的抗超阴离子氧活力,降低MDA含量（6.94±2.21 vs.11.43±1.18,P＜0.05;8.28±1.89vs.12.25±1.65,P＜0.05）,增强抗氧化酶的活性,如SOD（皮层缺血半暗带162.55±14.44 vs.124.47±13.86,P＜0.01;海马146.75±11.48 vs.105.29±10.55,P＜0.01）,CAT（皮层缺血半暗带22.47±2.89 vs.9.69±3.27;海马19.66±3.98 vs.7.62±3.77,均P＜0.01;皮层缺血中心区14.62±4.51vs.6.28±3.88,P＜0.05）,但对GSH-px影响不明显。结论:1、HBO预处理的保护作用可能是通过上调内源性抗氧化酶,如SOD、CAT等发挥作用。2、缺血皮层半暗带和中心区对HBO预处理有不同程度的氧化应激反应。第三部分高压氧预处理通过减少线粒体途径的凋亡诱导脑缺血再灌注损伤耐受目的:研究HBO预处理对线粒体途径凋亡的影响。方法:按照第一部分的方法进行高压氧预处理和造模。使用TUNEL法检测细胞凋亡;ELISA法检测caspase3和caspase9的酶活性;Western Blot检测cytochouromec,Bcl-2、和Bax蛋白的表达。结果:HBO预处理能明显减少缺血半暗带（84.57±18.75 vs.145.82±17.02,P＜0.01）和海马CA1区（67.58±18.30 vs.163.68±20.35,p＜0.01）的凋亡阳性细胞数,虽然在缺血中心区比MCAO组的缺血中心区凋亡细胞更多,但两者比较无统计学意义（80.43±15.47 vs.59.23±14.35,P＞0.05）。HBO+MCAO组和MCAO组缺血中心区的caspase-3和caspase-9酶相对活性无明显区别（P＞0.05）,但HBO预处理明显降低了两者在缺血半暗带和海马的活性（均P＜0.05）。HBO+MCAO组和MCAO组缺血中心区的胞浆cytochourome c水平相当（P＞0.05）,但HBO预处理减少了其在缺血半暗带和海马的表达（P＜0.05）。HBO预处理也提高了Bcl-2在缺血中心区（P＞0.05）、半暗带以及海马（均P＜0.05）的表达,对Bax水平影响不明显（P＞0.05）。MCAO组皮层和海马的Bax改变也不明显。结论:1、抑制线粒体途径的凋亡可能是高压氧预处理保护作用机制之一。2、缺血皮层半暗带和中心区再灌注损伤后表现为不同的死亡机制,HBO预处理对缺血程度不同的区域发挥不同程度的保护作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词表
• 前言
• 第一部分 高压氧预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护效应
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 高压氧预处理后氧化应激系统对脑缺血再灌注损伤的保护作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 高压氧预处理通过减少线粒体途径的凋亡诱导脑缺血再灌耐受
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 综述
• 参考文献
• 就读期间发表的文章和获得的奖励
• 致谢