论文摘要
疟疾严重威胁人们的健康,是全球重要的公共卫生问题,迫切需要采用高新技术寻求新的疟疾防治方法以控制流行。研制有效的疟疾疫苗是控制疟疾的主要措施之一,在这方面已有大量的研究和临床试验报道。疟疾主要流行于发展中国家或经济不发达地区,即使疟疾疫苗研发成功,如果价格高,也将是阻碍疫苗广泛应用的主要原因。转基因植物是有希望满足疫区条件的疫苗生产系统及投递系统。本研究利用转基因植物表达了恶性疟原虫3D7株裂殖子表面蛋白1 C末端基因（msp1-42）,并对表达蛋白的抗原性和免疫原性进行了研究,取得以下结果。1根据水稻偏爱的密码子重新设计了msp1-42基因序列,分别合成23对引物,采用两步PCR法拼接合成了完整的msp1-42基因。2为了检验合成的msp1-42基因能否在大肠杆菌中表达,并获得异源表达系统表达的MSP1-42抗原用于后续研究,对全合成的恶性疟原虫3D7株msp1-42基因起始密码子后的12个氨基酸用大肠杆菌偏爱的密码子进行改造（命名为Emsp1-42）后,构建至pET32a（+）表达载体,获得pET32amsp表达质粒,热激转化至有利于二硫键形成和增加蛋白可溶性的宿主菌Rosetta-gami（DE3）中,在25℃条件下进行诱导表达。结果从培养物上清中获得可溶性的eMSP1-42蛋白,纯化后条带均一,无其他杂蛋白;所获得的eMSP1-42蛋白能与识别MSP1-19构象表位的特异性单克隆抗体mAb5.9、PfCP2.9免疫兔血清以及恶性疟患者混合血清反应。用eMSP1-42与福氏佐剂免疫新西兰兔制备的免疫血清,能识别恶性疟原虫天然的抗原;可抑制体外培养恶性疟原虫（Hcc1/HN,海南分离株）生长,3只兔10%浓度免疫血清的原虫抑制率依次为（51.9±24.2）%、（29.4±8.6）%和（86.7±7.4）%,20%浓度的抑制率依次为（93.3±7.5）%、（65.3±10.6）%和（96.4±1）%。表明所合成的Emsp1-42基因能在大肠杆菌中表达,所表达的重组蛋白eMSP1-42具有抗原性和免疫原性。3为了探索研制疟疾植物口服疫苗的可行性,在水稻种子中表达恶性疟原虫（3D7株）主要表面蛋白C末端MSP1-42蛋白。将已按水稻偏爱的密码子重新合成的msp1-42基因（Rmsp1-42）与胚乳特异性表达的水稻种子储存蛋白麦谷蛋白基因的启动子GluB-4连接后,构建至植物双元表达载体pCAMBIA1300,获得p1300Gmsp表达质粒;将p1300Gmsp表达质粒电击转化至农杆菌EHA105,由农杆菌介导使Rmsp1-42插入水稻基因组DNA中,获得转基因水稻;采用PCR鉴定转基因植株,用ELISA、免疫印迹法和原位Western印迹等方法检测水稻种子中表达的MSP1-42蛋白（rMSP1-42）,用镍柱纯化rMSP1-42蛋白,与等体积的福氏佐剂乳化后,采用皮下注射方式免疫新西兰兔,制备免疫兔血清,用ELISA和IFA检测免疫血清中的特异性抗体,采用10%、20%的免疫血清体外培养恶性疟原虫,评价其体外抑制恶性疟原虫生长的效果。实验结果发现所合成的恶性疟原虫3D7株Rmsp1-42基因在水稻种子中获得了高表达,产量为189.56μg/g种子干重（56 g转基因种子可纯化出10.62 mg rMSP1-42蛋白）,由此推算的rMSP1-42蛋白在种子中的表达量约为总可溶性蛋白的1.56%。所产生的重组蛋白能与识别MSP1-42 C末端构象表位的mAb5.2单抗、PfCP2.9兔血清及恶性疟患者混合血清反应,皮下免疫新西兰兔能诱导特异性抗体的产生,免疫血清能识别恶性疟原虫天然的抗原;不同浓度的免疫血清均具有体外抑制疟原虫生长的作用,其抑制作用随免疫血清浓度的增加而增强,在10%浓度时,3只兔的抑制率依次为（18.2±8.5）%、（47.7±7.5）%和（40.6±9.7）%,20%浓度的抑制率依次为（77.3±7.5）%、（87.6±4.7）%和（87.2±3.7）%,说明在水稻种子中表达的rMSP1-42重组蛋白具有抗原性和免疫保护性,是潜在的用于生产疟原虫抗原的生产系统。4尝试将msp1-42基因转化至烟草叶绿体基因组中表达。对合成的msp1-42基因起始密码子后的12个氨基酸利用烟草偏爱的密码子优化,设计正反引物,从含msp1-42基因的pBluntmsp质粒中扩增出Cmsp1-42,构建烟草叶绿体表达载体LRrrmsp,通过基因枪转化法转化烟草叶片,在500 mg/L壮观霉素的选择下筛选转基因植株,采用PCR鉴定壮观霉素抗性植株,确认已将Cmsp1-42基因导入烟草叶绿体基因组中,获得转基因烟草。采用多重PCR分析表明经3次分化筛选后获得的植株尚未完全同质化。ELISA检测烟草叶片总蛋白中的cMSP1-42蛋白呈阴性反应。是mRNA不稳定还是表达出的蛋白被降解而导致cMSP1-42蛋白在烟草中不能积聚,还有待做进一步的分析。
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